|
|
The role of hybridization in plant evolution - using different methods for detecting plants of hybrid origin in the Elytrigia repens - Elytrigia intermedia hybrid complex
Paštová, Ladislava ; Krahulec, František (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent) ; Blattner, Frank (oponent)
Hybridizace je důležitým fenoménem v evoluci rostlin - je jedním ze zdrojů nové genetické variability. Hybridizací dochází ke sloučení genomů doposud izolovaných evolučních linií. Určování rostlin hybridního původu je výzvou v mnoha taxonomických skupinách. Velké spektrum metod bylo využito k jejich detekci od počátku botanického výzkumu. Zavedení genomické in situ hybridizace mělo velký dopad na studium rostlin hybridního původu. Tato molekulárně cytogenetická metoda umožňuje zjistit genomový příspěvek jednotlivých rodičovských druhů. Hybridizace (spolu s polyploidizací) významně přispěla k dnešní diverzitě tribu Triticeae. Většina druhů jsou allopolyploidy, kteří jsou výsledkem časté mezidruhové a mezirodové hybridizace. Struktura příbuzenských vztahů mezi zástupci tribu je tak značně retikulátní. Tato práce je zaměřena na studium hybridního komplexu Elytrigia repens - E. ×mucronata - E. intermedia. (1) Zástupci studovaného hybridního komplexu jsou málo morfologicky diferencovaní - jen 2 morfologické znaky jsou používány k jejich odlišení. Byla studována variabilita anatomických znaků listové čepele. Byly nalezeny znaky vhodné pro rozlišení rodičovských druhů. Využití znaků je omezeno, protože někteří kříženci nesou jen varianty znaků jednoho z rodičovských druhů. (2) Původ allohexaploidního...
|
|
|
Srovnání různých typů magnetických nosičů při mikroizolaci DNA z potravin
Koplík, Jerguš ; Lunerová,, Jana (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Byl optimalizován postup mikroizolace DNA v kvalitě pro PCR z vybraných čerstvých a sušených semen luštěnin a potravinových výrobků obsahujících luštěniny (humus). Pro optimalizaci byly použity magnetické mikročástice PGMAox a optimální navážka rostlinných a potravinových materiálů byla zvolena 200 mg. Pro čerstvé rostlinné materiály byl zvolen izolační postup zahrnující použití lyzačního roztoku s CTAB o objemu 500 L, 1 L -merkaptoethanolu a 500 L směsi chloroform-oktanol. Pro izolaci DNA ze sušených semen luštěnin a potravinových výrobků byl navýšen objem lyzačního roztoku s CTAB na 1 000 L. Pro dosažení vyšší čistoty DNA byly některé připravené homogenáty přesráženy isopropylalkoholem. Optimalizovaný proces izolace DNA byl použit při přípravě homogenátu z potravinových výrobků, ze kterých byla izolována DNA různými magnetickými nosiči. Pro srovnání magnetických nosičů byly použity neporézní nosiče poly(glycidylmethakrylát) PGMAox, poly(2-hydroxyethylmethakrylát-co-glycidylmethakrylát) P(HEMA-co-GMA)ox, pokryté karboxylovými skupinami a porézní hypersíťované mikročástice poly(styren-co-divinylbenzen) HPS-B-M-22-NH2, magnetické porézní sklo MPG a nanočástice oxidů železa pokryté poly(L-lysinem) PLL. V průměru nejvyšší koncentrace a nejlepší čistota DNA byla izolována použitím magnetických nosičů P(HEMA-co-GMA)ox a PGMAox.
|
|
|
Příprava vzorků pro analýzu DNA v potravinách rostlinného původu
Silná, Renata ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolace vysoce kvalitní rostlinné DNA je nezbytná pro mnoho aplikací molekulární biologie. Nicméně, rostlinná DNA a potraviny rostlinného původu obsahují velké množství polysacharidů, polyfenolů a jiných sekundárních metabolitů, které snižují výtěžnost a kvalitu izolované DNA. Cílem této diplomové práce byla příprava vzorků a různých potravinových matric pro izolaci DNA magnetickými částicemi. Jednalo se o 5 druhů zeleniny a 10 druhů různě zpracovaných zeleninových potravinových výrobků. Homogenizace matric byla provedena v CTAB pufru. Izolace rostlinné DNA byla provedena magnetickými částicemi s navázanými karboxylovými skupinami. Veškerá DNA byla izolována v kvalitě vhodné pro konvenční PCR, testována dvěma sadami primerů umožňujících amplifikaci 700 bp amplikonů, u tepelně zpracovaných výrobků na 220 bp a pro PCR v reálném čase. Byla srovnána účinnost separace magnetických částic s navázanou DNA pomocí magnetického separátoru a magnetické jehly. DNA vyšší čistoty byla izolována magnetickou jehlou. Mikrometoda izolace rostlinné DNA z homogenátů s CTAB pomocí magnetických částic je vhodná pro různě zpracované potraviny.
|
|
|
Využití magnetických částic pro izolaci a purifikaci DNA z výrobků pro dětskou výživu
Pešková, Aneta ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolace rostlinné DNA je komplikovaná z důvodu přítomnosti polyfenolů, polysacharidů a dalších metabolitů, které bývají izolovány současně s DNA. Tyto látky mohou mít vliv na výtěžek a kvalitu izolované DNA, a také mohou působit jako inhibitory PCR. Mezi moderní, jednoduché a rychlé metody izolace DNA v molekulárně biologických laboratořích patří magnetická separace, která využívá reverzní imobilizaci DNA na magnetické nosiče a umožňuje získání DNA ve vysoké kvalitě a čistotě. V experimentální části byla provedena mikroizolace rostlinné DNA ze zeleniny (mrkev), ovoce (hruška, jablko, citron, mango) a z tepelně zpracovaných potravinových výrobků pro děti (Hami první mrkvička, Nestlé ovocná kapsička, dmBIO hruška mrkev jablko, Hello ovocná přesnídávka s jablky a Hello ovocná přesnídávka s mangem). K izolaci DNA byly využity magnetické mikročástice PGMA 2 mg/ml a magnetické nanočástice funkcionalizované poly-L-lysinem (PLL) 0,2 mg/ml. Byla porovnána metoda izolace magnetických částic s navázanou DNA magnetickým separátorem a magnetickou jehlou. Kvalita a množství izolované DNA byly zjištěny spektrofotometrickou analýzou a amplifikovatelnost izolované DNA byla ověřena konvenční polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s primery specifickými pro rostlinnou ribosomální DNA (rDNA). Produkty PCR o velikosti 700, 350 a 220 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Z tepelně zpracovaných potravinových výrobků pro děti byla pomocí magnetických nosičů izolována DNA v kvalitě vhodné pro PCR. Detegovány byly však pouze kratší PCR produkty o velikosti 220 bp, což svědčí o degradaci DNA. Specifita PCR produktů byla stanovení analýzou délky restrikčního fragmentu (RFLP). Experimentální výsledky odpovídaly teoretickým výsledkům restrikční analýzy.
|
|
|
Izolace DNA z vybraných zeleninových výrobků (paprika)
Gőghová, Sabína ; Kuderová,, Alena (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá mikroizolací rostlinné DNA z 10 různých technologicky zpracovaných potravinových výrobků obsahujících papriku (Capsicum annum). DNA v kvalitě vhodné pro PCR byla izolována z homogenátů připravených v lyzačním roztoku s CTAB pomocí magnetických částic PGMA funkcionalizovaných karboxylovými skupinami. Kvantita a kvalita DNA byla stanovena spektrofotometricky a ověřena metodami PCR s primery specifickými pro rostlinnou rDNA. Kvalita izolované DNA se lišila v závislosti na technologickém zpracování výrobků. DNA izolovaná z uzené mleté papriky a z tepelně ošetřených výrobků (s výjimkou jednoho výrobku) byla degradovaná a amplifikovala se jen s primery F_26S a R_26S (produkt PCR o velikosti 220 bp) na rozdíl od primerů F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700 bp). DNA izolované z dalších potravinových výrobků se amplifikovaly s primery F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700bp). PCR produkt z jedné mleté papriky (Žitavská paprika) byl klonován a sekvencován.
|
|
|
Transcriptional response of plants to genotoxic stress and water deficit
Libus, Jiří ; Štorchová, Helena (vedoucí práce) ; Cvrčková, Fatima (oponent) ; Kovařík, Aleš (oponent)
7 Conclusions 1) cDNA array was prepared and used to assay transcript abundances of 376 selected Ara- bidopsis transcripts following various treatments with MMS. a) LoTrEC, clustering algorithm based on local trends of expression profiles, was de- signed and applied to the data. It succeeded to discover functionally rellevant clusters of expression profiles. b) Transcriptional responses to various MMS treatment regimes were investigated. While high MMS concentration seemed only to induce nonspecific stress reaction, the low and combined MMS resulted in a set of more specific expression changes. c) Expression levels of five transcripts were estimated by qRT-PCR. Trends of most of the profiles were confirmed. 2) Expression of 3 genes related to drought stress and/or response to cytokinin were mea- sured by qRT-PCR in wild type and ZOG1 transgenic plants. Transcript levels of all the genes were altered by water deficit. a) Although there are no significant macroscopic differences between wild type and ZOG1 transgenic plants, the mRNA abundances appeared to be influenced by the genotype. b) Leaf position (age) significantly influenced the expression of cig1 and ZOG1 driven by SAG12 promoter. c) RT primed with oligo-dT appeared more eficient than random hexanucleotide-primed reaction for 3 out of 5 mRNAs...
|
|
|
Identifikace a studium exprese genů účastnících se kvetení u modelové rostliny merlík červený (Chenopodium rebrum)
Cháb, David ; Štorchová, Helena (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent) ; Smýkal, Petr (oponent)
Souhrn Tatoprácesezabýá studiemmolekulrímíchzákladůfotoperiodickéindukcekveteníu modelovékátkodennírostlinymerlíkučerveného(Chenopodiumrubrum).Zaměřili jsme se na hledríLrria studiumexpresea fi.rrrkcehomologůgenůCoil,S77N,S(Co), FL)WERNG LoCUs r (FT) a LEAFY (LFY), klíčoýchregulátorůúčinkujícíchv signáni drázeindukce kvetenízávislénafotoperíoděu dlotltúenniArabidopsisthaliana. VtetraploidnímC' rubrwnjsme identifikovali dvaFT-lilre (FTL) geny_ CrFTL| a CrFTL2, lišícíse svými expresnímiprofily. CrFTL| by|o transkribovánoryÍnicky s maxímemuprostředdne.Za induktivníchfotoperiodiclcýchpodmínekkorelovalazr"ýšená expreseCrFTL| s míroukvetení'za neinduktivnichpodmínekneby|CrFTLI exprimován. ExpreseCrFTL2 byla za všechstudovanýchfotoperiodiclqýchrežimůkonstitutivn.CrFTL| je velmi pravděpodobněaktivátor kvďert, CzFTL2 se neúěastríkveteníza studovaných podmínekajehofunkcezůstrívánejasná. Dva Co-Iile (CoL) geny CrCoLL a CrCoL2 zC. rubrnt podléhajídosud nepopsanémutypu altemativníhosestřihua produkujídva t}py transkiptů.Jednaforma Íanskiptu ďpovídá standardnímusesřihu prvníhoajedinéhointronuv konzervovanépozici V druhéforměje navícvysťiŽena90 bp dlouhásekvenceodpovídajícíčástiprvníhoexonu' Všechnyět5rřiformy transkiptůvykazují stejnéřanskipční profily (ryErrickí exprese smaximemnakoncinoci)lišícísejenýškou...
|
|
|
Dynamika a mechanismus umlčování reportérového genu pro GFP v závislosti na aktivitě RDR6 a způsobu indukce RNA interference v buněčné linii tabáku BY-2
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent)
RNA interference (RNAi) je proces, který se u rostlin prostřednictvím malých RNA (sRNA = small RNA) významně podílí na regulaci genové exprese. Rozmanité dráhy RNAi lze rozdělit na dva základní mechanismy, a to posttranskripční a transkripční umlčování (PTGS a TGS). Vznik sRNA je vždy závislý na přítomnosti dvouvláknové molekuly RNA (dsRNA), která je štěpena některým z DCL proteinů za vzniku sRNA obvykle o délce 21 - 24 nt a jedno z vláken sRNA je následně rozpoznáno proteinem AGO. V případě PTGS interaguje komplex AGO- sRNA na základě komplementarity sekvence sRNA s cílovou RNA, kterou rozštěpí nebo zablokuje její translaci. U TGS reaguje AGO s rostlinně specifickou RNA Pol V a jejími transkripty, se kterými opět páruje vlákno sRNA nesené proteinem AGO. Tato interakce umožní sestavení komplexu proteinů, které indukují metylaci DNA a posléze i histonů, jež působí inhibičně na transkripci RNA Pol II. Způsobů, jakými může dsRNA vznikat, je celá řada. Velká část v buňce tvořených dsRNA je závislá na syntéze komplementárního vlákna do podoby dsRNA prostřednictvím RDR6 (RNA dependentní RNA polymeráza 6), která je zapojena i do procesu vzniku sekundárních sRNA. Význam RDR6 při PTGS byl zkoumán pomocí reportérového genu pro GFP, a to při samovolném umlčování a při umlčování vyvolaném třemi odlišnými...
|
|
|
The application of magnetic particles for DNA isolation from selected vegetable products
Akwari, Michala ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Micromethod of DNA isolation using magnetic particles is one of the modern technological methods used in DNA isolation, and makes the process simpler, more effective and faster. The main aim of this study was to isolate the DNA from various plant (tomato) food products, using different types of magnetic particles. The results were compared and the quantity, purity and the possibility of amplication of the isolated DNA among samples were found to be different. The DNA isolation method using magnetic particles P(HEMA-co-GMA) or HPS B-M-NH2 was shown to be the most effective in achieving the above mentiond parametres. DNAs from the analysed samples of plant food products were isolated in sufficient quantity and quality to be used in the conventional PCR. Differences in the possibility of the amplification of the isolated DNA stored at -20 °C during more than a half year were not found.
|
|
|
Variabilita exprese a umlčování transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2
Nocarová, Eva ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent) ; Kovařík, Aleš (oponent)
Závěry U suspenzních kultur buněčné linie tabáku BY-2 odvozených z kalusů po transformaci bylo po transformaci téměř 90 % linií tvořeno buňkami s různou mírou fluorescence GFP. Nově zavedená metoda klonování umožnila získání téměř poloviny klonů s homogenní expresí GFP z primárně heterogenních linií BY-2. Heterogenita exprese GFP u transgenních linií BY-2 měla původ jednak genetický (primární linie obsahovaly buňky s různými inzercemi T-DNA) a jednak epigenetický. Epigenetická heterogenita linií BY-2 souvisela s umlčováním transgenů, tvorbou stabilních epigenetických stavů brzy po transformaci a "permanentní heterogenitou" projevující se kolísavými změnami v expresi GFP. Snížení nebo umlčení exprese transgenů u bramboru bylo pozorováno přednostně u linií s vyšším počtem insercí T-DNA a s vyšší počáteční expresí GFP. Umlčení vždy postupně postihlo oba vnesené geny, přičemž vymizení exprese GFP předcházelo (v řádu měsíců) ve všech sledovaných případech ztrátě rezistence ke kanamycinu (umlčení genu NPTII), což naznačuje vzájemné propojení mezi umlčováním obou transgenů. Stejná posloupnost v umlčení obou transgenů byla také pozorována u umlčených linií po obnovení exprese transgenů 5-azacytidinem, který způsobuje demetylaci DNA. Byl navržen možný mechanismus postupného umlčování transgenů v rámci celých rostlin...
|
host ::
RSS.