|
|
Molecular mechanism of Cannabinoid receptor 1 regulation by SGIP1
Dvořáková, Michaela ; Blahoš, Jaroslav (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Stuchlík, Aleš (oponent)
Molekulární mechanismus regulace signalizace kanabinoidního receptoru 1 proteinem SGIP1 Abstrakt Src homology 3-domain growth factor receptor-bound 2-like endophilin interacting protein 1 (SGIP1) byl identifikován jako interakční partner kanabinoidního receptoru 1 (CB1R). Jejich protein-proteinová interakce byla potvrzena koimunoprecipitací. SGIP1 brání internalizaci aktivovaného CB1R a moduluje jeho signalizaci v buňkách HEK293. Pomocí elektrofyziologické metody terčíkového zámku jsme prokázali, že SGIP1 ovlivňuje signalizaci CB1R v autaptických hipokampálních neuronech. Sadou behaviorálních testů jsme zkoumali důsledky delece SGIP1 na chování regulované endokanabinoidním systémem u myší s konstitutivní delecí SGIP1 (SGIP1-/- ) a myší WT. U myší SGIP1-/- nebylo změněno zkoumání prostředí, pracovní paměť a senzomotorické učení. Myši SGIP1-/- byly méně úzkostlivé a depresivní. U samic SGIP1-/- byla zrychlena extinkce averzivní vzpomínky. Projevy kanabinoidní tetrády byly delecí SGIP1 taktéž ovlivněny. Samci SGIP1-/- vykazovali abnormální příznaky závislosti na THC. Delece SGIP1 také snížila akutní nocicepci a myši SGIP1-/- byly citlivější na antinocicepční účinky agonistů CB1R a morfinu. Interakce CB1R-SGIP1 vede k významné modifikaci signalizace CB1R. Pozorování in vivo dále naznačují, že SGIP1 ovlivňuje...
|
|
|
Vymezení úlohy NR1 podjednotky NMDA receptoru v patofyziologii schizofrenie.
Vrajová, Monika ; Horáček, Jiří (vedoucí práce) ; Blahoš, Jaroslav (oponent) ; Vyklický, Ladislav (oponent)
Souhrn Práce je zaměřena na roli NR1 podjednotky N-methyl-D-aspartátového receptoru v patofyziologii schizofrenie. Význam této podjednotky jsme studovali v animálním modelu, kde byly potkanům (kmene Wistar) do hipokampů aplikovány antisense oligodeoxynukleotidy (aODN) proti NR1, NR2A a NR2B podjednotkám (všechny kombinace). V chování jsme se zaměřili na změny v sensorimotorickém zpracování informací, hodnocené pomocí prepulzní inhibice úlekové reakce. Posléze jsme hodnotili exprese proteinů jednotlivých podjednotek a také exprese proteinů postsynaptické density (PSD-93, PSD-95). Výsledky našich experimentů ukázaly, že ani jedna z aplikovaných kombinací aODN nevyvolá významnou změnu prepulzní inhibice. Jedním z nejdůležitějších výsledků je statisticky významný pokles exprese PSD-95 ve skupinách s aplikací aNR2B a aNR2B.Další část disertační práce je věnována post mortem studii, kde jsme hodnotili expresi panNR1 podjednotky a jejích sestřižených variant na úrovni mRNA a proteinu v hipokampech pacientů, kteří trpěli schizofrenií a v hipokampech kontrol. V expresi mRNA panNR1 se ukázalo, že rozdíly mezi levým a pravým hipokampem jsou významně větší u pacientů než u kontrol. Sestřižené varianty na úrovni mRNA ukázaly pokles dvou izoforem (NR1-2, NR1-4) u pacientů oproti kontrolám. Exprese proteinů panNR1 i...
|
|
|
Kostní remodelace u revmatických onemocnění: Ztráta kosti u pacientů s juvenilní idiopatickou artritidou.
Brábníková Marešová, Kristýna ; Štěpán, Jan (vedoucí práce) ; Blahoš, Jaroslav (oponent) ; Hrnčíř, Zbyněk (oponent)
Úvod: Ve ztrátě kosti u juvenilní idiopatické artritidy (JIA) hraje významnou roli zánět. Prozánětlivé cytokiny i glukokortikoidy (GCs), mohou aktivovat osteoklastickou resorpci. Současně může být utlumena kostní novotvorba a to zejména prostřednictvím inhibitorů proteinů, které kontrolují diferenciaci osteoblastů. Cílem práce bylo ověřit hypotézu, že u pacientů s vysoce aktivní JIA se významně uplatňuje utlumení kostní novotvorby inhibitory Wingless (Wnt) proteinů - Dickkopfem 1 (Dkk-1) a sklerostinem. Kromě denzitometrického měření kostní a svalové hmoty byly hodnoceny markery aktivity onemocnění, kostního metabolismu a remodelace u mladých dospělých pacientů s JIA před a během 2 let anti TNFα (tumor necrosis factor α) léčby, která snižuje aktivitu onemocnění. Výsledky: U pacientů s JIA, kteří dosud nedostávali biologickou léčbu, byla oproti zdravým kontrolám významně nižší hustota kostního minerálu (BMD, g/cmš). Hodnoty BMD a složení těla u JIA významně závisely na trvání onemocnění JIA a na léčení GCs. Sérová koncentrace sklerostinu byla u JIA významně vyšší v porovnání s hodnotami u kontrolní skupiny zdravých osob. Hodnoty ostatních sledovaných markerů se mezi JIA a kontrolami nelišily. U pacientů byla zjištěna pozitivní korelace mezi Dkk-1 a C-reaktivním proteinem (hsCRP). Významná korelace...
|
|
|
Neurofarmakologie prostorové navigace a testy koordinace a flexibility v animálních modelech
Prokopová, Iva ; Stuchlík, Aleš (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Blahoš, Jaroslav (oponent)
Prostorová navigace, koordinace a behaviorální flexibilita patří mezi kognitivní funkce, které bývají často narušené u mnoha neuropsychiatrických onemocnění. K jejímu studiu slouží animální modely s farmakologickou či genetickou manipulací, jež lze testovat v behaviorálních úlohách. Naším prvním cílem bylo objasnit vliv interakce mezi β-adrenergním a α1-adrenergním či D2-dopaminergním systémem na kognitivní funkce potkanů. V obou případech došlo k narušení prostorové navigace a koordinace zvířat již při koaplikaci subterapeutických dávek daných antagonistů. Naše poznatky mohou mít dopad i na klinickou praxi vzhledem k rozšíření daných typů látek. Další studie byla zaměřená na určení efektu MK-801 (model schizofrenie) na behaviorální flexibilitu v bludišti Kolotoč a Morrisově vodním bludišti (MWM). Bludiště Kolotoč se zdá být senzitivnější na daný deficit, došlo k narušení výkonu potkanů již od dávek 0,08 mg/kg oproti 0,10 mg/kg v MWM. Naše nejnovější práce zkoumala vliv redukované exprese Nogo-A proteinu na prostorovou navigaci a behaviorální flexibilitu potkanů. Baterie testů v bludišti Kolotoč prokázala poškození daných parametrů, v MWM nebylo pozorováno poškození pracovní paměti. Nogo-A knock-down potkani mohou představovat endofenotyp podobný schizofrenii. Klíčová slova: prostorová navigace,...
|
|
|
Sledování kostního metabolismu ovlivněného vybranými léky
Gradošová, Iveta ; Živná, Helena (vedoucí práce) ; Broulík, Petr (oponent) ; Blahoš, Jaroslav (oponent)
Souhrn Sledování kostního metabolismu ovlivněného vybranými léky Osteoporóza patří mezi nejčastější metabolická kostní onemocnění, které se řadí mezi závažné civilizační choroby a představuje velký zdravotní a socioekonomický problém zvláště ve vyšších věkových kategoriích. Kardiovaskulární onemocnění jsou jedním z velkých problémů naší společnosti a nejčastější příčinou úmrtnosti na celém světě. Mezi hlavní rizikové faktory patří hypercholesterolémie a arteriální hypertenze, které jsme schopni účinně ovlivnit řadou léků. Prozatím nebyla věnována velká pozornost skutečnosti, zda a jak tyto léky ovlivňují kostní metabolismus. S přibývajícím věkem lidí se častěji vyskytuje hypertenze a hypercholesterolémie společně s progredujícím úbytkem kostní hmoty vedoucí až k osteoporóze. Mnohé studie naznačují, že antihypertenziva a hypolipidemika určitým způsobem zasahují i do kostního metabolismu. Předmětem zájmu předkládané práce bylo zkoumání vlivu vybraných, často předepisovaných, léčiv ze skupiny antihypertenziv (amlodipin, metoprolol) a hypolipidemik (ezetimib, atorvastatin) na kostní metabolismus u zdravých samců potkanů kmene Wistar a u potkanů po provedené orchidektomii (Wistar a spontánně hypertenzních potkanů). Během mého doktorského studia byly provedeny tři experimenty na potkanech se zmiňovanými léčivy. V...
|
|
|
Studies on molecular interactions of the mu-opioid and TRPV1 receptors
Melkes, Barbora ; Novotný, Jiří (vedoucí práce) ; Blahoš, Jaroslav (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
V této práci jsme zkoumali chování -opioidního receptoru (MOR) a iontového kanálu TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) v plazmatické membráně buněk a jejich vzájemnou komunikaci. Oba tyto receptory se podílejí na vnímání bolesti a analgezii. Zjistili jsme, že laterální pohyblivost MOR byla silně ovlivněna různými usměrňujícími opioidními agonisty. DAMGO a endomorfin-2 vykazují opačný usměrňovací agonismus vůči MOR. Podle našich výsledků mají také opačné účinky na mobilitu MOR. Morfin vyvolal pouze malé změny v mobilitě MOR. Kromě toho, deplece cholesterolu a blokování G proteinové signalizace za pomoci pertusového toxinu (PTX) ovlivňovaly schopnost agonistů MOR měnit jeho mobilitu. Účinky DAMGO a endomorfinu-2 byly za těchto podmínek sníženy. Na druhé straně jsme pozorovali morfinem zvýšený pohyb MOR po depleci cholesterolu. Samotný PTX neovlivnil pohyb receptoru, ale zcela narušil účinek deplece cholesterolu na morfinem vyvolanou změnu mobility MOR. Dále jsme se zabývali mobilitou TRPV1. Agonista TRPV1 kapsaicin změnil laterální mobilitu TRPV1. Překvapivě, po přidání MOR antagonisty naloxonu se také zvýšil difúzní koeficient TRPV1, ale v menší míře než po kapsaicinu. Agonista MOR DAMGO a antagonista levallorfan neovlivnily mobilitu TRPV1. Zjistili jsme, že kapsaicin i naloxon byly...
|
|
|
Vliv proteinu SGIP1 na partnery účastnící se signalizace kanabinoidního receptoru 1
Pejšková, Lucie ; Blahoš, Jaroslav (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent)
Receptory spřažené s G-proteiny (GPCRs) představují největší rodinu receptorů na buněčném povrchu. GPCR jsou aktivovány endogenními nebo exogenními ligandy. Navíc GPCR patří mezi molekuly, na které cílí až čtvrtina používaných léčiv. Po aktivaci receptoru dochází k buněčné signalizaci, při které jsou do buňky přenášeny informace z vnějšího prostředí. Na základě těchto přenášených informací mohou v buňce probíhat odpovědi. Klíčovým poznatkem pro tuto práci je souhra kanabinoidní a opioidní signalizace in vivo na nitrobuněčné úrovni, která může mít fyziologické dopady1 . Kanabinoidní a opioidní receptory patří do rodopsinové rodiny receptorů a jsou spřažené s Gαi/o proteiny2 . Kanabinoidní receptor 1 (CB1R) a μ-opioidní receptor (MOR) se společně vyskytují v některých oblastech centrálního nervového systému (CNS) a sdílejí mnoho důležitých vlastností. Aktivace obou receptorů inhibuje aktivitu adenylátcyklázy, čímž snižuje hladinu cyklického adenosinmonofosfátu v buňce, a moduluje extracelulárním signálem řízenou kinázu 1 a 2 (ERK1/2)2 . S ohledem na bohaté biochemické, farmakologické a anatomické důkazy podporující existenci funkčního spojení při aktivaci příslušných receptorů kanabinoidy a opioidy3 se toto téma stalo zajímavým i pro naše bádaní. Naše předešlá studie popisuje interakci mezi proteinem...
|
|
|
Struktura a funkce glutamátkarboxypeptidasy II
Šácha, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Šedo, Aleksi (oponent) ; Blahoš, Jaroslav (oponent)
4 Závěr GCPII je důležitý protein, který hraje roli v mnoha fyziologických i patologických procesech. Proto bylo třeba získat větší množství enzymaticky aktivního proteinu pro jeho další biochemický výzkum. Heterologní expresí v hmyzích buňkách S2 bylo exprimováno a následně purifikováno dostatečné množství velmi čistého a aktivního enzymu. To umožnilo jeho biochemickou charakterizaci, krystalizaci a později vedlo i k vyřešení krystalové struktury. GCPII je aktivní v širokém rozmezí pH 6 - 8, s maximem kolem pH 7,5. Zjistili jsme, že kromě přirozeného substrátu Ac-Asp-Glu GCPII štěpí také acetylované dipeptidy Ac-Asp-Met, Ac-Glu-Met, Ac-Glu-Glu, Ac-Ala-Glu a Ac-Ala-Met. U těchto substrátů byly změřeny kinetické parametry štěpení. Nalezení dalších substrátů může vést k objevení dosud nepopsaných fyziologických rolí GCPII. Také byly porovnány hodnoty IC50 inhibitorů známých z literatury u námi připravené GCPII a GCPII izolované z potkaních mozků. IC50 bylo u všech méně specifických inhibitorů nižší u rekombinantní GCPII než u GCPII izolované z mozků. Rozdíly ve výsledcích vysvětlujeme vazbou méně specifických inhibitorů na jiné proteiny preparátů z mozku. Vůbec nepochybujeme o tom, že data získaná za použití čistého rekombinantního proteinu jsou přesnější než ta, ktará byla získána ze špatně definovaných...
|
|
|
Structure, activity and metabolism of human glutamate carboxypeptidase II
Mlčochová, Petra ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Blahoš, Jaroslav (oponent) ; Šedo, Aleksi (oponent)
ZAVER Nedávno publikované krystalové stÍuktuly GCPII poskytly náhled do organizace vazebné kapsy pro substrát a odhali|y něko|ik aminokyse|in, které se podílejína vazbě substrátu/inhibitoru vsl' místě enzymu. Abychom doplnili a rozšíři|istrukturní studie, vytvořili jsme QM/T\4M model GCPII v komplexu se substrátem, N.acetyl-aspartyl. glutamátem (NAAG). To nám umožnilo předpovědět dalšíaminokyseliny důleŽitépro vazbu substrátu. Využili jsme místně speciťrcké mutageneze. abychom odhalili vliv těchto jednotlivých aminokyselin na vazbu substÍátu/inhibitoru a na enzymovou aktivitu GCPII. Poěítačovýmodel komp|exu GCPIVNAAG společněs výsledky z místně specifické mutageneze, ukazuje žeaminokyse|iny v S1' místě (váaající glutarát) jsou nezbytné pro vysokou ďinitu substrátu nebo inhibitoru, zatímco, zbytky v s1 místě jsou více dťúežitépři přeměně substrátu a mohly by hrát nějakou roli v kata|ytickém mechanismu enzymu. Přestože QMA4M model nám umožni|předpovědět strukturu a interakce mezi substrátem a enzymem v Sl místě, komp|exní popis reakčníhomechanismu GCPII je zatím mimo rámec našich možností. V blízkébudoucnosti bychom se rádi dozvěděli víceinformací o katalytickém mechanismu GCPII. Chceme se zaměřit na Glu424' který je situovián v bezprostřední blízkosti zinkťr v aktivním místě a s největší pravděpodobností se...
|
|
|
Role of proteins associated with the Cannabinoid receptor 1 in endocannabinoid signaling
Vozárová, Denisa ; Blahoš, Jaroslav (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent)
Dôležitým predpokladom pre zachovanie homeostázy a správnej funkčnosti v každom živom organizme je schopnosť buniek komunikovať medzi sebou a okolitým prostredím. Bunka je prostredníctvom receptorov schopná neustále spracovávať obrovské množstvo extracelulárnych podnetov, ktoré sú do nej ďalej prenášané. Najväčšiu triedu predstavujú receptory spojené s G-proteínmi, do ktorej sa zaraďuje aj Kanabinoidný receptor typu 1 (CB1R). Endokanabinoidný systém reguluje v tele radu dôležitých procesov ako je učenie, príjem potravy, motorika a iné. Obezita predstavuje veľký problém súčasnej spoločnosti, pričom snaha o objasnenie jej molekulárno-genetickej podstaty viedla k objaveniu proteínu Src homology 3-domain growth factor receptor-bound 2-like (endophilin) interacting protein 1 (SGIP1). Tento proteín sa podieľa na regulácii energetickej rovnováhy a jeho nadexpresia vedie k vývoju obezity. SGIP1 bol detekovaný ako interakčný partner CB1R, pričom sa zistilo, že je zapojený do procesu internalizácie receptora prostredníctvom klatrínovej endocytózy (CME). Kľúčovými proteínmi pre jej iniciáciu a rannú fázu sú FCHO1/2, s ktorými vykazuje SGIP1 vysokú sekvenčnú homológiu. Avšak vplyv SGIP1 na internalizáciu aktivovaného receptora je narozdiel od FCHO1/2 inhibičný, pričom mechanizmus jeho pôsobenia zatiaľ nie je...
|
host ::
RSS.