Název:
Modifikované nukleotidy a DNA pro elektrochemické značení a definovanou prezentaci malých molekul
Překlad názvu:
Modified nucleotides and DNA for electrochemical labelling and defined display of small molecules
Autoři:
Krömer, Matouš ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Křen, Vladimír (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent) Typ dokumentu: Disertační práce
Rok:
2023
Jazyk:
eng
Abstrakt: [eng][cze] This thesis is focused on enzymatic construction of DNA probes for electrochemical labelling, bioconjugations and, in the final part, building on knowledge gathered in previous chapters, it describes a method useful for construction of highly functionalized base-modified DNA enabling defined multivalent display of glycosides. In first chapter, a chemical route to diol-bearing nucleotides was found. Sonogashira reaction facilitated access to alkyne-tethered diols and subsequent catalytic hydrogenation, described for the first time in the literature, provided protection-free method for obtaining nucleotide diols tethered via flexible sp3 hybridized linker. Cleavage of alkane-linked, but not alkyne-linked, nucleotide diols yielded aliphatic nucleotide aldehyde. All nucleotides were found to be good substrates for KOD XL DNA polymerase in both primer extension and polymerase chain reaction, apart from aldehyde-linked dUCHO TP nucleotide, which performed well in PEX reaction, but gave PCR products only in a mixture with natural dTTP. This could be overcome by cleavage of diol-modified DNA, which also yielded aldehyde-functionalized dsDNA. All reactive probes were examined for bioconjugations with fluorescent hydrazine, reductive amination with lysine or lysine-containing peptides or other molecules...Souhrn Tato práce je zaměřena na enzymatickou syntézu sond pro elektrochemické značení, biokonjugace a ve své závěrečné kapitole, postavené na poznatcích získaných v předchozích částech, popisuje metodu pro přípravu vysoce funkcionalizované DNA modifikované na bázích, využitelnou pro kontrolovanou multivalentní prezentaci glykosidů. V první částí byla nalezena metoda pro přípravu nukleotidů nesoucích diolové skupiny. Sonogashirova reakce umožnila přístup k diolům připojeným přes alkynovou spojku, následná katalytická hydrogenace, poprvé popsána v literatuře, poté poskytla cestu k diolům připojeným přes flexibilní sp3 hybridizovanou spojku, a to bez použití chránících skupin. Štěpení diolů připojených k nukleotidům přes sp3 spojku, nikoliv však přes alkynovou spojku, vedlo ke vzniku nukleotidu modifikovaného alifatickým aldehydem. Všechny nukleotidy byly dobrými substráty pro KOD XL DNA polymerázu, jak v reakci extenze primeru, tak v polymerázové řetězové reakci, vyjma aldehydem modifikovaného dUTP, který byl akceptován v PEX, ale produkty PCR reakce vznikaly pouze ve směsích s přirozeným dTTP. Toto omezení bylo překonáno štěpením diolů až po inkorporaci do DNA, čímž také vznikla DNA modifikovaná aldehydovými skupinami. Všechny reaktivní sondy byly použiti pro biokonjugace s fluorescenčním hydrazeinem, pro...
Klíčová slova:
biokonjugace; DNA; elektrochemie; glykokonjugáty; nukleotidy; polymerázy; bioconjugations; DNA; electrochemistry; glycoconjugates; nucleotides; polymerases