|
|
Biocompatible protein cages for encapsulation and internatization of small interfering RNA
Mokrý, Michal ; Balvan, Jan (oponent) ; Heger, Zbyněk (vedoucí práce)
This thesis is focused on creation of apoferritin nanocarrier with encapsulated small interfering RNA marked with fluorescent dye. Main objectives are optimization of pH and amount of siRNA encapsulated into apoferritin cavity and physicochemical characteristics of created nanocarrier. First part deals with theoretical knowledge necessary for understanding concept of this thesis. Second part describes used methods and evaluated results. Created apoferritin nanocarriers were optimal in size with great hemocompatibility, but long-term stability didn’t meet our expectations.
|
|
|
Vliv povrchových modifikací lipidových nanočástic na jejich vlastnosti
Mašková, Vendula
Cílem diplomové práce bylo studovat vliv povrchových úprav lipozomálních nanočástic na jejich fyzikálně-chemické vlastnosti a zhodnocení jejich příjmu buňkami in vitro. Za tímto účelem byly pro srovnání připraveny dva typy lipozomálních nanočástic (LNPs), které se lišily rozdílnou citlivostí ke změnám pH, tedy pH senzitivní LNPs, které ve svém složení obsahují lipid CPA (cholesteryl-PEG350-aminoxylipid), na nějž se oximovou vazbou navázal PEG (propionaldehyd polyethylenglykolu), a pH nesenzitivní LNPs obsahující DSPE-PEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin-polyethylenglykolem). Do těchto nanočástic byla enkapsulována siRNA a byla studována stabilita při skladování, pH senzitivita, štěpení pH senzitivní vazby, formace proteinové korony a jejich pohlcování buňkami HepG2. S použitím hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF byla při snižování pH ověřena pH senzitivita vazeb mezi PEGem a CPA, případně mezi PEGem a DSPE. Při studiu pH senzitivity byla také sledována velikost nanočástic, PDI a zeta potenciál. Dle výsledků se pH nesenzitivní LNPs skutečně jevily jako inertní vůči změně pH a pH senzitivní LNPs vykazovaly změny v parametrech při pH 6,0. Dále byla posuzována stabilita obou typů LNPs při dlouhodobém skladování za rozdílných teplotních podmínek na základě změny velikosti a PDI. Připravené LNPs se po celou dobu experimentu i při různých teplotách jevily jako velikostně uniformní a stabilní. Výjimkou byly LNPs s fluorescenčním značením, které v rámci sledovaných parametrů vykazovaly horší stabilitu. V neposlední řadě byl potvrzen vliv povrchových modifikací na snížení tvorby proteinových koron. Připravené LNPs taktéž efektivně vstupovaly do buněk a do 24 hodin došlo k uvolnění siRNA do cytoplazmy z pH senzitivních LNPs a pravděpodobné akumulaci siRNA v endozomech v případě pH nesenzitivních LNPs. Na základě výsledků práce lze usuzovat, že připravené pH senzitivní LNPs vykazují žádoucí chování v biologických systémech, a tudíž mají potenciál jako vhodný nosič pro dopravu siRNA v rámci biologických aplikací.
|
|
|
AGO-hook domény v metylaci DNA řízené malými RNA u Arabidopsis thaliana
Teznerová, Kateřina ; Čermák, Vojtěch (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Metylace DNA řízená malými RNA (RdDM) je důležitá dráha, jež prostřednictvím navození metylace DNA reguluje genovou expresi a podílí se na obraně proti invazivním DNA elementům (zejména transposonům). Klíčovou roli v RdDM dráze hrají proteiny Argonaut (AGO) s malými RNA (sRNA), které jsou k cílové DNA sekvenčně komplementární. S proteiny Argonaut jsou schopné interagovat domény zvané AGO-hooky. U rostlin se v RdDM dráze uplatňují dva proteiny s AGO-hook doménami: NRPE1 a SPT5L. Na řešitelském pracovišti bylo nedávno objeveno, že součástí komplexu Pol V (stejně jako zmíněné dva proteiny) je ještě třetí protein SPT6L. Role SPT6L role dosud nebyla popsána, ale předpokládáme, že rovněž hraje roli v RdDM dráze. Tato práce se zabývá studiem všech tří AGO-hook domén přítomných v Pol V komplexu a jejich rolí v RdDM dráze u rostliny Arabidopsis thaliana, od přípravy mutantů postrádajících různé kombinace uvedených AGO-hook domén po studium jejich role a zastupitelnosti při metylaci DNA v různých lokusech. Klíčová slova AGO-hook, Arabidopsis thaliana, NRPE1, SPT5L, SPT6L, siRNA, epigenetické značení chromatinu, protein Argonaut
|
|
|
Role malých RNA v transgenerační stresové paměti rostlin
Jaklová, Veronika ; Marková, Hana (vedoucí práce) ; Lipavská, Helena (oponent)
Rostliny jsou neustále ovlivňovány různými abiotickými i biotickými stresy, které vyvolávají celou řadu reakcí. Výsledkem může být zvýšená tolerance rostlin vůči různým stresovým faktorům jako je napadení herbivory nebo nedostatek vody. Tato odolnost může být mimo jiné i epigenetickými mechanismy přenesenaina další generace.Natvorbě mezigeneračníivícegeneračnístresové pamětise mohouhojně podílet malé RNA sloužící jako signální molekuly rychlé odpovědi rostliny na stres. MiRNA jsou převážně regulátorygenové exprese,prostřednictvímsvých inhibičních a degradačních aktivit řídí transkripci genů a translaci velkého množství proteinů. SiRNA by se mohly účastnit přenosu transkripční paměti prostřednictvímmechanismuRNA řízenéDNA methylace (RdDM).Methylace DNA ahistonovémodifikace společně slouží jako chromatinové značky, jež je možné epigeneticky přenést do dalších generací. Na základě toho pak rostliny odvozené od stresu vystavených rodičovských rostlin vykazují velké změny v genové expresioprotirostlinám s nestresovanýmirodiči.Tyto změnypak přetrvávajípo různě dlouhou dobu v závislosti na tom, zda je opět genová exprese indukována stresovým faktorem či nikoli. Zájem o pochopení mechanismů transgenerační stresové paměti v poslední době značně vzrostl a tyto znalosti mohou již brzy umožnit jejich...
|
|
|
Optimalizace přípravy lipozomálních nosičů pro cílený transport terapeutických nukleových kyselin
Maráková, Ester
Tato bakalářská práce s názvem „Optimalizace přípravy lipozomálních nosičů pro cílený transport terapeutických nukleových kyselin“ se zabývá využitím lipozomálních nanopřenašečů a mechanismu RNA interference prostřednictvím siRNA v cílené terapii. Cílem této práce bylo optimalizovat přípravu komplexu liposomů, polyethylenkglykolu a siRNA pro další výzkum a vypracovat odbornou rešerši o této problematice. V rámci praktické části této práce byly připraveny kationické lipozomy ze směsi lipidů v molárním poměru 20:50:10:20 (DODAG, DOPE, cholesterol, CPA·HCl), do kterých byla po extruzi enkapsulována kontrolní siRNA a na jejich povrch byly navázány dva druhy polyethylenglykolu: PEG2000 a PEG2120. Praktická část této práce sestávala ze tří hlavních experimentů, kterými byly: sledování vlivu množství enkapsulované siRNA, sledování vlivu míry PEGylace a stabilitní studie dlouhodobého skladování liposomů po dobu tří měsíců. V závěru této práce byly vybrány vzorky liposomů vyfotografovány na skenovacím elektronovém mikroskopu. Ve všech experimentech byla pomocí dynamického rozptylu světla sledována velikost, PDI a ζ potenciál. V experimentu, který se zabýval vlivem množství enkapsulované siRNA, jsme zaznamenali se zvyšujícím se množstvím siRNA nárůst velikosti. Na základě výsledků získaných v druhém experimentu byly pro stabilitní studii zvoleny liposomy s mírou PEGylace 5 % pro PEG2000 a 2 % pro PEG2120, jako pufr byl vybrán fosfátový pufr (PBS) (v rámci experimentu vliv míry PEGylace byl porovnáván s puferem 20 mM HEP 135 mM NaCl). V rámci studie dlouhodobého skladování se nám podařilo prokázat potenciál liposomů fungovat jako stabilní přenašeče pro terapeutika. Jelikož při měření po 28 dnech došlo pravděpodobně k narušení struktur těchto komplexů, je zřejmé, že by bylo vhodné podniknout další optimalizační kroky, jako je například použití rychlé proteinové kapalinové chromatografie (FPLC), nebo použití komerčních lipidů s inkorporovaným PEGem, pro snížení této chybovosti.
|
|
|
Ovlivnění kvality, funkce a výsledků transplantace pankreatických ostrůvků pomocí RNA interference
Kosinová, Lucie ; Kříž, Jan (vedoucí práce) ; Štechová, Kateřina (oponent) ; Petrák, Ondřej (oponent)
Transplantace inzulín produkující tkáně je v současnosti jedinou léčebnou metodou umožňující diabetikům 1. typu dosáhnout dlouhodobé nezávislosti na aplikaci inzulínu. Alternativní metodu k orgánové transplantaci pankreatu představuje transplantace izolovaných Langerhansových ostrůvků (LO) do jater, která je bezpečnější, ale méně účinná. Důvodem je výrazná ztráta ostrůvků během krátkého času po transplantaci způsobená nespecifickou zánětlivou reakcí IBMIR (z angl. instant blood-mediated inflammatory reaction). Hlavní příčinou této reakce je tkáňový faktor exprimovaný na povrchu buněk LO, který po kontaktu s krví příjemce přímo aktivuje koagulační kaskádu tzv. vnější cestou. Dochází k agregaci trombocytů, aktivaci komplementu a infiltraci ostrůvků leukocyty, což má za následek zničení až 60 % transplantované tkáně a vznik ischemických oblastí v játrech. Tkáňový faktor kromě koagulace ovlivňuje také angiogenezi a jeho přítomnost na povrchu buněk LO v pozdějším stádiu po transplantaci je naopak nezbytná pro jejich revaskularizaci. Inhibice genu pro tkáňový faktor v izolovaných LO pomocí RNA interference nabízí možnost krátkodobého potlačení exprese tohoto proteinu, což by znamenalo ochranu ostrůvků v raném posttransplantačním období a současně později nebránilo napojení kapilár na cévní systém...
|
|
|
Metylace DNA řízená malými RNA u Arabidopsis thaliana
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Rozdílná transkripční aktivita různých oblastí genomu je zajišťována epigenetickými modifikacemi, mezi které patří metylace DNA, úprava N-koncových aminokyselin histonů a změny v zastoupení histonových variant. RNA interference je regulační proces, při kterém dochází prostřednictvím malých RNA odvozených z exogenních či endogenních sekvencí k posttrankripčnímu nebo transkripčnímu umlčení těchto sekvencí. 24-nukleotidové siRNA, tvořící část malých RNA, řídí de novo metylaci a spoluúčastní se udržování metylace DNA (RNA-directed DNA methylation; RdDM), která se podílí na transkripčním umlčení heterochromatinu a transponovatelných elementů, vyskytujících se u rostlin ve velkém množství. Pro krytosemenné je také charakteristická přítomnost RNA polymeráz IV a V účastnících se v této dráze, které byly poprvé objeveny v genomu Arabidopsis thaliana, jež se stala hlavní modelovou rostlinou i pro studium RdDM. Polymeráza IV přepisuje prekurzory siRNA; siRNA jsou následně asociované s AGO4 proteiny a navádějí metylační enzymy na cílové sekvence prostřednictvím komplementarity s transkripty polymerázy V.
|
|
|
RNA interference u rostlin
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kulich, Ivan (oponent)
RNA interference je jedním z dějů, které umožňují v buňkách regulovat aktivitu genů. Tento proces je většinou spouštěn přítomností dvoušroubovicové RNA v buňce. Z takovéto RNA mohou být vyštěpovány duplexy malých RNA, většinou o délce 20-25 nukleotidů, za pomoci proteinu zvaného Dicer. Jednovláknové malé RNA uvolněné z těchto duplexů jsou základním kamenem RNA interference a lze je třídit do několika skupin na základě jejich biogeneze. U rostlin se setkáváme s miRNA a siRNA. Malé RNA asociují s proteinem zvaným Argonaut a navádějí jej na základě sekvenční komplementarity k cílové molekule. Argonaut může fungovat buďto sám nebo v komplexu s jinými proteiny. V závislosti na charakteru proteinů účastnících se tohoto děje spouští malé RNA různorodé procesy, které mohou vést ke štěpení mRNA (proces, na který stačí samotný komplex Argonaut a malá RNA), blokování translace nebo modifikacím chromatinu. S RNA interferencí se lze setkat u většiny Eukaryot, kde hraje roli ve vývoji organismů, jejich reakci na stres, úpravách chromatinu a také v obraně proti virům. U rostlin se setkáváme s rozmanitou škálou mechanismů, kterými může RNAi fungovat a kterým začínáme teprve postupně rozumět a doceňovat jejich význam.
|
|
|
Preparation and characterization of diamond-based nanocarriers for transfection of siRNA
Majer, Jan ; Cígler, Petr (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Ačkoliv nanodiamanty byly objeveny a připraveny před desítkami let, až nedávno se začaly využívat v medicínských a biologických oborech, zejména pro doručení léčiv a genetického materiálu do buňky a v biozobrazovacích metodách. Nanodiamanty mohou být modifikovány specifickými, pozitivně nabitými skupinami pro komplexaci s negativně nabitými nukleovými kyselinami. Tyto komplexy následně překonávají extracelulární a intracelulární bariéry a transportují nukleové kyseliny buďto do cytosolu nebo do jádra. Díky fluorescenčním centrům dusík-vakance, které mohou být v nanodiamantech vytvořeny, vykazují nanodiamanty vynikající optické vlastnosti pro sledování transfekce, protože emitují stabilní fluorescenci bez "photoblinkingu" a "photobleachingu". Tato práce shrnuje vlastnosti, syntézu, modifikace nanodiamantů a dalších vybraných nanočástic a jejich in vitro aplikace. Porovnává také jejich cytotoxicitu a efektivitu genového "knockdownu".
|
|
|
Reporter gene studies for nanoparticle mediated DNA and siRNA delivery.
Kovářová, Barbora ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Hofman, Jakub (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biochemických věd University of Vienna, Faculty center for Pharmacy, Department of Pharmaceutical Chemistry, Laboratory of MacroMolecular Cancer Therapeutics Kandidát: Barbora Kovářová Školitel (Univerzita Karlova): PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Školitel (University of Vienna): Univ. Prof. Dipl. Ing. Dr. Manfred Ogris Konzultant (University of Vienna): Dr. Haider Sami, Ph.D. Název diplomové práce: Studie nanočásticemi zprostředkovaného dopravování DNA a siRNA založené na reportérovém genu Klíčová slova: transfekce, plasmidová DNA, siRNA, nanočástice Genová terapie je nadějný obor, který nabízí potenciál k léčbě mnoha nevyléčitelných chorob. Je zprostředkována modulací genové exprese ve specifických buňkách pomocí dopravení exogenní nukleové kyseliny do těchto buněk. Jednou ze současných výzev dopravování nukleových kyselin je výzkum syntetických vektorů, které mají potenciál překonat nevýhody běžně používaných vektorů virových. Tato práce je zaměřena na různé typy nanočástic založených na polyethyleniminu pro dopravování plasmidové DNA (pDNA) a small interfering RNA (siRNA). Spojení kontrastních zobrazovacích činidel se systémy pro dopravování genů nabízí mnoho výhod pro sledování procesu dopravování genů jak in vivo tak i in...
|
host ::
RSS.