|
|
Vacuolar aspartic protease of Candida albicans
Hirko, Dominik ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Dostál, Jiří (oponent)
Aspartátové proteázy (AP) mají zásadní význam pro různé buněčné procesy. Tato diplomová práce se zabývá problematikou exprese a charakterizace vakuolární aspartátové endoproteasy Apr1p z Candida albicans a srovnává ji s jejím orthologem Pep4p ze Saccharomyces cerevisiae. Rekombinantní exprese Apr1p v Escherichia coli poskytla neaktivní proenzym, proApr1p. Rozsáhlé snahy o aktivaci nevedly k maturaci Apr1p, což naznačuje závislost aktivace na posttranslačních modifikacích, jako je glykosylace a specifické interakce s jinými proteázami podobně jako u Pep4p. Pokusy o využití vakuolárních enzymů nebo buněčných lyzátů k aktivaci proApr1p byly také neúspěšné, což může být způsobeno křehkostí izolovaných vakuol a komplexní směsí enzymů v buněčných lyzátech ztěžjucií analýzu aktivace. Tyto problémy podtrhují složitou povahu aktivace proteas kdy ani různe in vitro techniky nedokážou simulovat in vivo aktivaci proteas. Slibné výsledky se však objevily u heterologní exprese proApr1p v Saccharomyces cerevisiae, kde frakcionovaný buněčný lyzát vykazovaly specifickou proteolytickou aktivitu při kyselém pH po inhibici jiných proteáz. To by mohlo naznačovat, že Apr1p může být produkován v aktivní formě v rámci eukaryotického systému, nicméně je třeba dále zkoumat jeho purifikaci. Experiment s reciproční výměnou...
|
|
|
Vliv vybraných lékařských hub a dalších prebiotik na růst a metabolismus probiotických bakterií.
Husová, Martina ; Bendová, Agáta (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá vlivem lékařských hub a dalších prebiotik na růst a biologickou aktivitu probiotických bakterií. Vybrané rody bakterií mléčného kvašení Bifidobacterium a Lactobacillus produkují antimikrobiální látky bakteriociny a jejich produkce je závislá na kultivačních podmínkách a dostupných zdrojích živin. Teoretická rešerše popisuje a charakterizuje probiotické bakterie, jejich metabolismus a význam pro lidské zdraví. Podobným způsobem se teoretická část věnuje prebiotikům a jejich vybraným zástupcům, kterými jsou čtyři druhy lékařských hub, mikroskopická řasa rodu Chlorella, rezistentní škrob, buněčná biomasa kvasinky Saccharomyces cerevisiae a doplňky stravy jako inulin a psyllium. V rámci experimentální části byly připraveny z těchto prebiotik extrakty třemi různými způsoby – varem, louhováním a hydrolýzou. Získané extrakty byly charakterizovány z hlediska obsahu makronutrientů, jako byly sacharidy a bílkoviny. Na základě růstu čtyř druhů bakterií mléčného kvašení kultivovaných ve standardním médiu a jejich produkce antimikrobiálních látek byl pro kultivaci v prebiotických extraktech vybrán kmen Bifidobacter bifidum. Po stanovení nárůstu probiotické biomasy v médiích s prebiotiky byly kultury odstředěny a v bakteriálním supernatantu byl stanoven obsah proteinů. V lyofilizovaných probiotických extraktech byl stanoven obsah kyseliny mléčné vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií, a nakonec proběhlo stanovení antimikrobiální aktivity bujónovou diluční metodou a resazurinovým testem viability. Výsledky antimikrobiálních testů byly srovnány s antimikrobiální aktivitou kyseliny mléčné o stejné koncentraci, v jaké byla obsažena v probiotických extraktech. Pro nejvyšší obsah makronutrientů v prebiotických extraktech je nejvhodnější metodou extrakce var. Pro nerozpustné polysacharidy typu rezistentního škrobu je vhodná hydrolýza, ovšem ta vyžaduje následnou úpravu extraktu, aby poskytoval vhodné podmínky pro kultivaci. Extrakty připraveny varem nejvíce podpořily růst probiotických bakterií a zároveň jejich produkci antimikrobiálních látek. U těchto vzorků byly naměřeny nejvyšší koncentrace bílkovin a kyseliny mléčné. U všech typů kultivace byla potvrzena pravděpodobná přítomnost bakteriocinů. Téměř všechny probiotické extrakty vykazovaly antimikrobiální aktivitu proti Staphylococcus epidermidis a Escherichia. coli. Bujónovou diluční metodou byla opět potvrzena pravděpodobná přítomnost bakteriocinů například v extraktech s obsahem řasy chlorely či kvasinky S. cerevisiae, protože tyto extrakty působily antimikrobiálně při nižších koncentracích než obsažená kyselina mléčná.
|
|
|
Studium vlivu faradaických procesů na účinnost elektroporace kvasinek
Martinů, Dominik ; Krčma, František (oponent) ; Ehlich, Jiří (vedoucí práce)
Elektroporace je metoda široce využívaná v biotechnologii a ve zdravotnictví. Spočívá v aplikaci krátkých intenzivních elektrických pulzů, díky kterým dochází k tvorbě pórů v buněčné membráně. Skrze tyto póry následně dochází k výměně molekul mezi elektrolytem a intracelulárním prostředím. Ačkoli je elektroporace standardně využívanou technikou, její přesný mechanismus je stále neznámý a předmětem současného výzkumu. Předpokládá se, že hlavním mechanismem elektroporace je samotné působení elektrického pole. Nedávné studie však naznačují, že jedním z doprovodných mechanismů může být také působení reaktivních forem kyslíku (ROS) a obecně produktů faradaických procesů. Tyto silně oxidující molekuly mohou mít vliv jak na účinnost elektroporace, tak na viabilitu buněk. Hypotézou bylo, že anodizací elektroporačních elektrod, tj. vytvořením tenké vrstvy dielektrika na jejich povrchu je možné zabránit produkci ROS. Následným srovnáním účinnosti elektroporace za použití připravených kapacitních elektrod a klasických faradaických elektrod lze odhalit efekt ROS na elektroporaci. Byla zmapována produkce H2O2 jakožto zástupce ROS při použití standardních elektroporačních pufrů, protokolů a různých elektrodových materiálů. Koncentrace H2O2 byla stanovena spektrofotometricky jeho reakcí s 3,3',5,5'-tetramethylbenzidinem (TMB) za katalýzy enzymem křenová peroxidáza (HRP). Byly vybrány takové elektrody, aby bylo dosaženo nízké, střední a vysoké produkce H2O2. Vybrané elektrody byly použity k in vitro elektroporaci kvasinek Saccharomyces cerevisiae, přičemž účinnost permeabilizace byla stanovována elektrochemickou impedanční spektroskopií (EIS) a měřením fluorescence dopraveného propidium jodidu (PI). Bylo zjištěno, že působení ROS není hlavním mechanismem tvorby pórů v buněčné membráně během elektroporace a nemá významný vliv na účinnost této metody. Výsledky však nevylučují jejich roli v sekundárních procesech, které ovlivňují kinetiku uzavírání pórů a viabilitu buněk po elektroporaci.
|
|
|
Enzymatická hydrolýza odpadní papíroviny - zdroj suroviny pro výrobu kapalných biopaliv
Lepař, Petr ; Stloukal, Radek (oponent) ; Gabriel, Petr (vedoucí práce)
Diplomová práce pojednává o procesu enzymatické hydrolýzy odpadní papíroviny jako zdroje pro výrobu kapalných biopaliv. Navazuje bezprostředně na stejnojmennou diplomovou práci Ing. Brummera, je jejím pokračováním a vychází z poznatků, které byly v předchozí práci vyřešeny a rozhodnuty. V teoretické části jsou shrnuty základní informace o enzymatické hydrolýze odpadní papíroviny a s tím související vlivy různých faktorů na rychlost a stupeň hydrolýzy. Zvýšená pozornost je věnována odpadní lepence a metodám její předúpravy s ohledem na maximalizaci výtěžku hydrolýzy. Další část shrnuje možnosti fermentační výroby biopaliva se zaměřením na metodu simultánní sacharifikace a fermentace, u které je podrobněji diskutován výběr vhodného mikroorganismu pro etanolové kvašení. Poslední část je věnována návrhu technologického postupu od vstupu suroviny až po separaci vzniklého etanolu. V experimentální části byla zkoumána předúprava odpadní papíroviny za účelem maximalizace efektivity hydrolýzy. Nejlepších výsledků bylo dosaženo za použití vibračního mlýna. Dále byly optimalizovány jednotlivé parametry simultánní sacharifikace a fermentace za použití enzymů společnosti Novozymes® a kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Byla sledována míra přeměny celulózy obsažené v odpadní papírovině na redukující sacharidy spektrofotometrickou metodou dle Somogyi – Nelsona a množství vznikajícího etanolu bylo kvantifikováno za pomoci HPLC/RI. V rámci práce byly optimalizovány podmínky (množství enzymů, substrátu, živin, kvasinek, teplota, pH, druh pufru) s ohledem na maximalizaci efektivity celkového procesu. Veškeré experimenty byly prováděny na vlnité lepence, která byla zvolena v diplomové práci Ing. Brummera jako nejperspektivnější materiál k hydrolýze patřící mezi odpadní papírovinu.
|
|
|
Centrifugační analýza mikrobiálních buněk
Beránková, Barbora ; Müllerová, Lucie (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem centrifugačního potenciálu mikroorganismů v závislosti na kultivačních podmínkách. V experimentální části byla sledována především rychlost sedimentace a index nestability studovaných mikroorganismů během růstu, při působení teplotního a solného stresu, vliv složení média na centrifugaci a působení vody na halofilní bakterii Haloferax mediterranei. S klesající osmotickou sílou v bakteriální kultuře Haloferax mediterranei roste rychlost sedimentace a index nestability. Při sledování růstu bakterií Cupriavidus necator H16, Cupriavidus necator PHB-4, Haloferax mediterranei, Burkholderia cepacia a Burkholderia sacchari hraje roli při rychlosti sedimentace a indexu nestability přítomnost a typ polyhydroxyalkanoátu (PHA) v bakteriální biomase. Bakterie Cupriavidu necator H16 s nejvyšším přítomným obsahem poly(3-hydroxyburyrátu) byla nejrychleji sedimentující a nejvíce nestabilní ze sledovaných bakterií. Bakterie Cupriavidus necator H16 a její PHA neprodukující mutant Cupriavidus necator PHB-4, vystavené teplotnímu a solnému stresu, vykazovaly při teplotním stresu pouze nepatrný vliv na rychlost sedimentace a nestabilitu. U solného stresu s rostoucí koncentrací roztoku NaCl v kultuře klesala rychlost sedimentace a index nestability. Při porovnávání vlivu složení média na polyhydroxyalkanoáty (PHA) produkující bakterie, Cupriavidus necator H16 kultivovaná v minerálním (produkčním) médiu vykazovala nejnižší rychlost sedimentace a index nestability, přičemž Cupriavidus necator PHB-4 dosahovala nejnižší rychlosti sedimentace a indexu nestability při kultivaci v Nutrient Broth médiu. U kvasinky Saccharomyces cerevisiae měla volba média pouze nepatrný vliv na rychlost sedimentace a index nestability.
|
|
|
Sledování vlastností kvasinek v průběhu kvašení piva
Kociánová, Lenka ; Vítová, Eva (oponent) ; Omelková, Jiřina (vedoucí práce)
V diplomové práci byl sledován průběh kvašení ve spilce vybraného pivovaru, závislosti různých faktorů a jejích případný vliv na vitalitu a viabilitu nasazovaných kvasnic, což mělo ukázat opodstatněnou vícenásobnou použitelnost kvasničného kmene v rámci správného technologického procesu kvašení piva. Předmětem sledování byli i další faktory: fyziologický stav kvasnic, pH, teplota, množství jemných a hrubých kalů, mnpožství rozpuštěného kyslíku v mladině, stupeň prokvašení mladiny. Ke stanovení se odebíraly vzorky kvasící mladiny a vypraných násadnéch kvasnic. Použitý kmen násadních kvasnic byl sledován od jeho prvního nasazení až po poslední (celkově byl nasezen 4x po sobě). U odebraných vzorků mladiny bylo vždy změřeno pH, teplota, zdánlivé prokvašení (průměrně od 4. dne od zakvašení) a počet buněk.Před každým dalším nasazením byly kvasnice vyprány a byla stanovena jejich vitalita. Metodou vitálného barvení se sledoval podíl mrtvých buněk v suspenzi kvasnic určených pro další nasazení. Množství mrtvých buněk bylo vždy pod mezní hodnotou 5%, v jednom případě nebyla nalezena dokonce žádná mrtvá buňka v odebraném vzorku. Důležitým faktorem, především pro pomnožení kvasnic, bylo množství rozpuštěného kyslíku v mladině. Byly provedeny zkoušky s nedostatečně provzdušněnou mladinou. Pomocí těchto zkoušek bylo dokázáno, že při nedostatečném provzdušnění mladiny O2 se prodloužila doba hlavného kvašení v průměru o 3 – 4 dny. Byly provedeny i zkoušky s vyšším obsahem kalů v mladině, při nichž bylo dokázáno, že yšší obsah kalů, nemá významný vliv na průběh hlavného kvašení a na vlastnosti kvasnic. Cílem této práce bylo na základě zpracovaných výsledků sledovaných parametrů u opětovně nasazovaného (celkově 4x) kmene pivovarských kvasnic během hlavního kvašení, potvrdit správnost jednotlivých opakovaných nasazeních v průběhu technologického procesu.
|
|
|
Emergent properties of the G1/S network
Dražková, Jana ; Tomášek, Petr (oponent) ; Palumbo,, Pasquale (vedoucí práce)
In this thesis we deal with the cell cycle of the yeast Saccharomyces cerevisiae. We are interested in its G1 to S transition, and our main goal is to determine the cell size at the onset of its DNA replication. At first, we study a recent mathematical model describing the mechanisms leading to the S phase, we provide its detailed description and present the dynamics of some significant protein and protein complexes. Further, we take a closer look at the probabilistic model for firing of DNA replication origins. We newly consider the influence of DNA replication spreading among neighboring origins, and we analyze its consequences. We also provide a sensitivity analysis of the critical cell size with respect to rate constants of G1 to S transition model.
|
|
|
Studie možnosti využití odpadního pečiva k bioprodukci vybraných metabolitů
Hudečková, Helena ; Vránová, Dana (oponent) ; Babák, Libor (vedoucí práce)
Cílem této diplomové práce bylo studium možnosti využití odpadního pečiva k bioprodukci vybraných metabolitů. Jako odpadní pečivo byl použit odpadní chléb dodaný kavárnou Zastávka. Chléb byl předupraven mletím na malé částice a dále z něj byla vytvořena 15 % w/v suspenze, která byla podrobena enzymatické hydrolýze. Na hydrolýzu byla použita -amylasa pro ztekucení substrátu a po ní následovala glukoamylasa, která daný substrát sacharifikovala. Bylo provedeno několik způsobů hydrolýz, z nichž nejoptimálnější byla dále použita na předúpravu substrátu před fermentací. Účinnost a průběh hydrolýz byly stanoveny spektrofotometrickou metodou podle Somogyiho-Nelsona. Konečné výtěžky glukosy z hydrolýz byly stanoveny metodou HPLC. Po enzymatické hydrolýze následovala fermentace, která byla provedena dvěma způsoby, a to s úpravou pH hydrolyzátu na hodnotu 5 a bez úpravy pH. Během fermentací byly prováděny odběry, ve kterých byl stanoven obsah glukosy, ethanolu a glycerolu metodou HPLC. Fermentace probíhala za teploty 30 °C s použitím kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Nejvyššího výtěžku glukosy bylo dosaženo u hydrolýzy ve dvou krocích (70,28 gl-1), avšak pro fermentaci byla použita metoda směsné hydrolýzy („směsná 2“) s výtěžkem 67,94 gl-1. Nejvyššího výtěžku ethanolu bylo dosaženo během fermentace bez úpravy pH, a to 31,5 gl-1.
|
|
|
Study on potential applications of glutamic acid polymer
Čangelová, Katarína ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
The subject of the thesis is study of possible applications of isoform of glutamic acid polymer (-PGA). The theoretical part is focused on the properties of this biopolymer and potential applications in various areas. Producers and mechanisms of biosynthesis are also mentioned. In the experimental part, the polymer was firstly characterised by following methods: FT-IR spectroscopy, TGA, DSC and SEC-MALS. Its isoelectric point, antimicrobial activity and solubility in various solvents were also determined. The biopolymer was also precipitated by divalent cations and its interaction with oppositely charged CTAB surfactant was studied. The main experimental study was researching the effect of -PGA on viability of Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus rhamnosus under stress conditions by flow cytometry. The performed stresses included ethanol exposure, high temperature and freezing stress, in which its effects were compared to conventional cryoprotectants. The cells of the mentioned microorganisms were also stressed osmotically and exposed to model gastrointestinal juices - gastric, pancreatic and bile. The protective effects of -PGA on the cells were recorded in ethanol stress on Lactobacillus rhamnosus. Its excellent cryoprotection properties were confirmed and its protective effect of gastric juice exposure on Saccharomyces cerevisiae cells was also observed. At the end of the experimental part, -PGA/alginate beads suitable for encapsulation of probiotic bacteria and -PGA/chitosan nanoparticles for encapsulation of biologically active substances.
|
|
|
Studium biokonverze celulosového odpadu na ethanol s využitím kvasinkových systémů
Čalová, Iveta ; Vítová, Eva (oponent) ; Babák, Libor (vedoucí práce)
Diplomová práce pojednává o optimalizaci produkce ethanolu z odpadního papíru pomocí kvasinek. Jako substrát byly použity 4 druhy papíru – kancelářský papír, nerecyklovaný sešit, recyklovaný sešit a noviny. Všechny papíry byly předupraveny následujícími postupy mletí, mikrovlny + NaOH, mikrovlny + H2SO4 a mikrovlny + H2SO4 + NaOH. Pomocí enzymů byla provedena enzymatická hydrolýza, při které byla stanovena koncentrace glukózy pomocí HPLC. Pro produkci ethanolu byly vybrány kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Produkce ethanolu probíhala při simultánní sacharifikaci a fermentaci se všemi předupravenými papíry. Během hydrolýzy dosahovaly nejvyšších výsledků papíry předupravené kombinací mikrovln + H2SO4 + NaOH. Jedinou výjimku tvořil nerecyklovaný sešit, kde byla nejvyšší koncentrace glukózy získána předúpravou mikrovlny + H2SO4. Bylo dosaženo těchto výsledků: kancelářský papír 24,69 gdm-3, nerecyklovaný sešit 22,47 gdm-3, recyklovaný sešit 16,94 gdm-3 a noviny 15,36 gdm-3. SSF byla provedena opět se všemi papíry a jejich předúpravami. Nejvyšších koncentrací ethanolu bylo dosaženo u předúpravy mikrovlny + H2SO4 + NaOH. Celkově nejvyšší koncentrace byla získána z kancelářského papíru a činila 16,98 gdm-3. U nerecyklovaného sešitu dosahovala maximální koncentrace ethanolu 15,25 gdm-3, v případě recyklovaného sešitu 12,2 gdm-3 a u novin 12,59 gdm-3.
|
host ::
RSS.