|
|
Specificita interakcí protein-protein a jejich modulace
Pham, Phuong Ngoc ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Damborský, Jiří (oponent) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
(CZ) Protein-proteinové interakce (PPI) mají zásadní roli v životních procesech a jejich abnormality jsou často spojené s vznikem nemocí. Vzhledem ke své důležitosti dostávají PPI čím dál tím více pozornosti a staly se cíli zásahu různých léčiv. Návrh konkrétních PPI a jejich modulace je však náročný. Interakce cytokinů s jejich receptory jsou zvláště důležité při regulaci imunitního systému. Nadměrná produkce interleukinu-10 (IL-10) má za následek nadměrné imunosupresivní účinky, růst nádoru a infekci. Interakce mezi receptorem interferonu gama 2 (IFN-γR2) a interferonem gama (IFN-γ) vede k aktivaci signálních drah, ale mechanismus takové interakce je stále nepopsaný. Interleukin-24 (IL-24) je další cytokin, který signalizuje prostřednictvím receptorů sdílejících receptorovou podjednotku 2 interleukinu-20 (IL-20R2) a má důležitou roli v autoimunitě a rakovině. Cílem této Ph.D. práce je studium PPI z několika hledisek s důrazem na jejich specifičnost. Prvním cílem je vyvinout nové proteinové lešení, které bude následně použito pro vývoj vysokoafinitního pojiva specifického pro lidský IL-10. Druhým cílem je pochopení strukturního základu receptorové specifity lidského IFN-γ. Třetím cílem je modulace vazebné afinity mezi lidským IL-24 a jeho receptorem IL-20R2 za použití foto-responzivních...
|
|
|
Discovery of General Controů Nondereprssible 5 protein interactors using proximity labeling
Potapenkova, Uliana
Proteiny obvykle nepůsobí jako samostatné jednotky, ale plní svou funkci v komplexech s jinými proteiny. Identifikace protein-proteinových interakcí (PPI) přináší vhled do regulace vývojových procesů rostlin a jejich reakcí na podmínky prostředí. V posledních letech bylo vyvinuto několik metod pro studium PPI, jelikož představují klíčové cíle výzkumu biologie rostlinného systému. Tato práce je zaměřena na metodu Proximity Labeling (PL) a to za účelem studia proteinových interaktorů GCN5. GCN5 je histonacetyltransferáza, která hraje klíčovou roli v obranných reakcích rostlin na různé abiotické stresy. Studie jeho interaktorů poskytují cenné informace o mechanismech acetylace histonů a způsobu, jakým se rostliny vyrovnávají s nepříznivými podmínkami. Zde jsou shrnuty výhody a nevýhody PL metody a ta je porovnána s jinými metodami studií PPI. Experimentální část téhle práce byla zaměřena na klonování GCN5 a přípravu plazmidu pro budoucí proximitní značení na bázi biotinu.
|
|
|
Interakce proteinových podjednotek SEC10 a SEC15 poutacího komplexu exocyst
Bartáková, Anna ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Exocyst je evolučně konzervovaný poutací komplex zapojený do regulace sekreční dráhy v eukaryotických buňkách. Jakožto efektor malých GTPáz zásadně přispívá ke správnému cílení sekrečních váčků do místa intenzivní exocytózy na plazmatické membráně díky interakci se specifickými fosfolipidy. Komplex exocyst se skládá z osmi podjednotek: SEC3, SEC5, SEC6, SEC8, SEC10, SEC15, EXO70 a EXO84, přičemž každá podjednotka se váže s minimálně dvěma dalšími podjednotkami. Pro funkci exocystu je klíčová interakce SEC10 a SEC15. Otázkou zůstává, jak jsou tyto dvě podjednotky v rámci rostlin funkčně konzervované. Geny SEC10 a SEC15 ze zástupců tří evolučně rozdílných skupin rostlin (zelené řasy - Klebsormidium nitens, mechu - Marchantia polymorpha, krytosemenné - Arabidopsis thaliana) byly klonovány do vektorů kvasinkového dvouhybridního systému pro studium proteinových interakcí. Testování vzájemné interakce SEC10 a SEC15 z odlišných druhů rostlin v kvasinkovém dvouhybridním systému ukázalo, že i přes variabilitu v proteinových sekvencích těchto podjednotek, zůstává jejich interakce napříč evolučními skupinami rostlin velmi dobře zachována.
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Pichová, Iva (oponent) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Moderní metody studia protein-proteinových interakcí
Křivková, Jana ; Hrdý, Ivan (vedoucí práce) ; Kučerová, Jitka (oponent)
Protein-proteinové interakce (PPI) hrají nepostradatelnou roli ve všech procesech v živých buňkách. Pochopení interakcí mezi proteiny nám umožňuje bližší popis buněčných dějů a jejich pochopení otevírá nové možnosti i pro návrh léčiv. Důležitost otázky studia PPI se odráží v recentním rozvoji různorodých metod pro jejich identifikaci a popis. Cílem této práce je sumarizovat poznatky o nových a zdokonalených experimentálních metodách identifikace a charakterizace proteinových interakcí. Metody popsané v této práci jsou členěny do čtyř kapitol, metody blízkostí indukovaného značení proteinů (BioID, BioID2, APEX, TurboID, MiniTurbo, PUP-IT, AirID, SPPLAT, EMARS), využití síťování proteinů pro jejich identifikaci a strukturní charakterizaci (XL-MS), fluorescenční metody identifikace a vizualizace (BiFC, FRET, BRET) a biofyzikální metody pro stanovení kinetických či termodynamických parametrů interakce (SPR, ITC, MT).
|
|
|
Modulation of interactions of cytokines and their receptors
Kolářová, Lucie ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
(In Czech) Protein-proteinové interakce, stejně jako interakce s dalšími molekulami například DNA a RNA, hrají důležitou roli v široké škále biologických aktivit a procesů v živých buňkách. Pochopení proteinových interakcí, nové přístupy a nástroje pro modulaci těchto interakcí jsou důležité pro medicínskou a biotechnologickou oblast výzkumu a vývoje. Jako modelový systém pro studium biologických interakcí a modulaci biologických funkcí jsme využili interleukiny z rodiny 10. Podmínkou studia biologických procesů a pochopení biomolekulárních interakcí je příprava rekombinantních proteinů, které jsou stabilní v širokém spektru podmínek. Exprese rekombinantních proteinů v dostatečném množství a kvalitě je ale často náročným úkolem. Naším cílem bylo proto vytvořit nové přístupy k produkci složitých proteinů. V této práci popisujeme modifikaci interleukinu-24 (IL-24), člena skupiny IL-10 rodiny pomocí níž jsme dosáhli zvýšení exprese a stability IL-24. Práce ukazuje, že aplikace proteinového inženýrství je vhodným nástrojem pro studium složitých proteinů. V druhé části této práce jsme se zaměřili na nové postupy v přípravě malých vazebných proteinů (skafoldů). Malé vazebné proteiny se staly ve vývoji proteinových léčiv slibnou alternativou k široce využívaným protilátkám. Nové vazebné proteiny se...
|
|
|
Targeted modifications of the protein-protein interactions: Ternary complex of interferon-γ as a model system
Zahradník, Jiří ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Klíčovým požadavkem pro detailní porozumění biologických procesů, až na molekulární úroveň, je znalost struktury interagujících molekul a jejich komplexů. Jako modelový systém, pro naši studii, jsme si zvolili IFN-γ. Ačkoliv je tato molekula jedním ze zásadních modulátorů imunitní odpovědi, a je studována již více než 60 let, tak struktura přídavného receptoru (IFN-γR2) a porozumění celému komplexu je nedostačující. V této práci jsme se nejprve zabývali binárním systémem IFN-γ s jeho receptorem, který vykazuje vysokou afinitu k IFN-γ a prostorová struktura obou dvou molekul je známa. Zaměřili jsme se tedy na modulaci afinity mezi IFN-γ a tímto receptorem. Náš přístup spočíval v inovativní metodě založené na modulaci stability protein-proteinových interakcí pomocí mutagenizace aminokyselinových zbytků umístěných uvnitř struktury proteinu. Podařilo se nám zvýšit afinitu testované interakce sedmkrát. Druhá část projektu byla zaměřena na krystalizaci, vyřešení a popis struktury druhého - přídavného receptoru pro IFN-γ. Naše analýza variabilních aminokyselinových zbytků na povrchu tohoto proteinu a strukturně příbuzných receptorů z rodiny typu II odhalila možné vazebné místo pro IFN-γ. Ve třetí části naší práce jsme se zaměřili na krystalizaci IFN-γ z platýze druhu Paralichthys olivaceus a tuto...
|
|
|
Targeted modifications of the protein-protein interactions: Ternary complex of interferon-γ as a model system
Zahradník, Jiří
Klíčovým požadavkem pro detailní porozumění biologických procesů, až na molekulární úroveň, je znalost struktury interagujících molekul a jejich komplexů. Jako modelový systém, pro naši studii, jsme si zvolili IFN-γ. Ačkoliv je tato molekula jedním ze zásadních modulátorů imunitní odpovědi, a je studována již více než 60 let, tak struktura přídavného receptoru (IFN-γR2) a porozumění celému komplexu je nedostačující. V této práci jsme se nejprve zabývali binárním systémem IFN-γ s jeho receptorem, který vykazuje vysokou afinitu k IFN-γ a prostorová struktura obou dvou molekul je známa. Zaměřili jsme se tedy na modulaci afinity mezi IFN-γ a tímto receptorem. Náš přístup spočíval v inovativní metodě založené na modulaci stability protein-proteinových interakcí pomocí mutagenizace aminokyselinových zbytků umístěných uvnitř struktury proteinu. Podařilo se nám zvýšit afinitu testované interakce sedmkrát. Druhá část projektu byla zaměřena na krystalizaci, vyřešení a popis struktury druhého - přídavného receptoru pro IFN-γ. Naše analýza variabilních aminokyselinových zbytků na povrchu tohoto proteinu a strukturně příbuzných receptorů z rodiny typu II odhalila možné vazebné místo pro IFN-γ. Ve třetí části naší práce jsme se zaměřili na krystalizaci IFN-γ z platýze druhu Paralichthys olivaceus a tuto...
|
|
|
Targeted modifications of the protein-protein interactions: Ternary complex of interferon-γ as a model system
Zahradník, Jiří
Klíčovým požadavkem pro detailní porozumění biologických procesů, až na molekulární úroveň, je znalost struktury interagujících molekul a jejich komplexů. Jako modelový systém, pro naši studii, jsme si zvolili IFN-γ. Ačkoliv je tato molekula jedním ze zásadních modulátorů imunitní odpovědi, a je studována již více než 60 let, tak struktura přídavného receptoru (IFN-γR2) a porozumění celému komplexu je nedostačující. V této práci jsme se nejprve zabývali binárním systémem IFN-γ s jeho receptorem, který vykazuje vysokou afinitu k IFN-γ a prostorová struktura obou dvou molekul je známa. Zaměřili jsme se tedy na modulaci afinity mezi IFN-γ a tímto receptorem. Náš přístup spočíval v inovativní metodě založené na modulaci stability protein-proteinových interakcí pomocí mutagenizace aminokyselinových zbytků umístěných uvnitř struktury proteinu. Podařilo se nám zvýšit afinitu testované interakce sedmkrát. Druhá část projektu byla zaměřena na krystalizaci, vyřešení a popis struktury druhého - přídavného receptoru pro IFN-γ. Naše analýza variabilních aminokyselinových zbytků na povrchu tohoto proteinu a strukturně příbuzných receptorů z rodiny typu II odhalila možné vazebné místo pro IFN-γ. Ve třetí části naší práce jsme se zaměřili na krystalizaci IFN-γ z platýze druhu Paralichthys olivaceus a tuto...
|
host ::
RSS.