|
|
Anaerobic fungi and herbivores
Pristašová, Paulína ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
Anaeróbne huby Neocallimastigomycotina patria k anaeróbnym symbiontom bachorového mikrobiómu. Táto špecifická skupina húb patrí k bazálnym líniám ríše Fungi, odlišujúca sa od aeróbnych zástupcov húb v mnohých aspektoch, vrátane prítomnosti hydrogenozómov a tvorbou celulozómov. V bachore prebieha ich kompletný životný cyklus, zahrňujúci pohyblivé zoospóry, ktoré po kolonizácií rastlinnej biomasy vyklíčia vo vegetatívnu stielku, tvoriacu sporangium. V ekosystéme bachoru patria k primárnym kolonizátorom rastlinnej biomasy, kedy pomocou extracelulárnych multienzýmovych komplexov- celulozómov, degradujú odolnú bunkovú stenu rastlín. Schopnosť tvoriť celulozómy, doposiaľ pozorovanú len u prokaryot, získali horizontálnym génovým prenosom od bachorových baktérií. Výsledkom ich spoločnej koevolúcie sú taktiež pozorované syntrofické reakcie s metanogénmi, ktoré využívajú hubovými hydrogenzómami vytvorený H2. Ich potencionálne biotechnologické využitie zahrňuje tvorbu bioplynu, či zefektívnenie zisku z potravy hospodárskeho dobytka. Kľúčové slová: anaeróbne huby, bachor, hydrogenozóm, celulozóm
|
|
|
Molekulární charakterizace faktorů účastnících se tvorby cystové stěny Giardia intestinalis.
Pastyříková, Aneta ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
1 Abstrakt Povrch cyst Giardia intestinalis pokrývá silná vláknitá stěna poskytující parazitovi potřebnou ochranu před vnějším prostředím. Materiál cystové stěny se skládá z proteinů a sacharidů. Hlavní sacharid, unikátní β-1,3-N-acetylgalaktosaminový homopolymer (označovaný jako Giardan), je syntetizován z glukózy cytosolickými enzymy indukovanými během encystace. Tato práce se zaměřuje na ověření biosyntézy Giardanu a funkční charakterizaci UDP-N-acetylglukosamin 4'- epimerázy (UA4E), jednoho z enzymů účastnících se syntetické dráhy. Pro tyto účely byl odpovídající gen cíleně odstraněn za využití systému CRISPR/Cas9. Byla získána stabilní buněčná linie, ve které byly odstraněny všechny čtyři kopie genu UA4E. Úspěšnost genového knock-outu byla potvrzena na základě proteomické analýzy. Pomocí fluorescenční mikroskopie jsme pozorovali, že ΔUA4E buňky indukované k encystaci jsou schopny iniciovat encystační procesy a procházet buněčnou diferenciací. U buněk byla pozorována přítomnost ESV váčků a typické morfologické znaky odpovídající cystám. Tato stadia však měla tenkou povrchovou vrstvu a nebyla schopna vytvořit typickou silnou stěnu s fibrilárním vzhledem na jejich povrchu, což vedlo k následné produkci neživotaschopných cyst. Klíčová slova Giardia intestinalis, Giardan, UDP-N-acetylglukosamin...
|
|
|
Moderní metody studia protein-proteinových interakcí
Křivková, Jana ; Hrdý, Ivan (vedoucí práce) ; Kučerová, Jitka (oponent)
Protein-proteinové interakce (PPI) hrají nepostradatelnou roli ve všech procesech v živých buňkách. Pochopení interakcí mezi proteiny nám umožňuje bližší popis buněčných dějů a jejich pochopení otevírá nové možnosti i pro návrh léčiv. Důležitost otázky studia PPI se odráží v recentním rozvoji různorodých metod pro jejich identifikaci a popis. Cílem této práce je sumarizovat poznatky o nových a zdokonalených experimentálních metodách identifikace a charakterizace proteinových interakcí. Metody popsané v této práci jsou členěny do čtyř kapitol, metody blízkostí indukovaného značení proteinů (BioID, BioID2, APEX, TurboID, MiniTurbo, PUP-IT, AirID, SPPLAT, EMARS), využití síťování proteinů pro jejich identifikaci a strukturní charakterizaci (XL-MS), fluorescenční metody identifikace a vizualizace (BiFC, FRET, BRET) a biofyzikální metody pro stanovení kinetických či termodynamických parametrů interakce (SPR, ITC, MT).
|
|
|
Nová proteáza v redukovaných mitochondriích Giardia intestinalis.
Vondráčková, Pavlína ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
Proteom mitosomů lidského patogena Giardia intestinalis je v současnosti reprezentován méně než dvaceti proteiny, které jsou importovány z cytoplasmy, kompletně totiž chybí mitochondriální genom. N-koncové sekvence, které zacilují tyto proteiny do mitosomů jsou podobně jako v "klasických" mitochondriích, uvnitř organel odštěpeny specifickými peptidázami a zbylý protein tak může nabýt nativní konformace. Ze tří hlavních typů mitochondriálních peptidáz je v mitosomech G. intestinalis přítomna pouze funkční polovina enzymu MPP, což je situace naprosto unikátní v celé eukaryotické říši. Na základě proteomické analýzy jsme v mitosomech identifikovali novou peptidázu (Peptidáza X) a nyní se pokoušíme o její detailnější charakteristiku. Pomocí overexprese s hemaglutininovým tagem byla ověřena mitosomální lokalizace proteinu a dále byla charakterizována přesná distribuce proteinu do mitosomálních subkompartmentů pomocí specifické protilátky. Za použití sodium karbonátové extrakce byla zjištěna membránová lokalizace Peptidázy X. Pomocí protease protection assay se nám podařilo zjistit, že protein je zakotven ve vnitřní mitosomální membráně a exponován do mitosomální matrix. Samotná Peptidáza X nese na N-konci mitochondriální targetovací sekvenci, která je schopna zajistit transport proteinu do kvasinkové...
|
|
|
Homology pyruvát:feredoxin oxidoreduktázy z hydrogenosomů Trichomonas vaginalis
Zedníková, Věra ; Hrdý, Ivan (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
Oxidativní dekarboxylace pyruvátu je důležitá reakce v metabolismu organismů vedoucí ke konzervaci energie. Enzym katalyzující tuto reakci u některých anaerobních či mikroaerofilních eukaryotních a prokaryotních organismů se nazývá pyruvát:feredoxin oxidoreduktáza (PFO). PFO obsahuje železo-sirné skupiny a váže tiamin pyrofosfát (TPP). V reakci katalyzované pomocí PFO, která může být i reverzibilní, vznikají z pyruvátu a CoA produkty acetyl-CoA, CO2 a uvolňují se dva elektrony. Tyto elektrony předává PFO nízkomolekulárním proteinovým přenašečům. Ve většině případů jsou tyto přenašeče feredoxiny, popřípadě flavodoxiny jako je tomu u bakterií fixujících dusík. Jeden z organismů vlastnící PFO jsou trichomonády, většinou parazitičtí či endosymbiotičtí anaerobní prvoci. PFO trichomonád se nachází v hydrogenosomech, organelách mitochondriálního typu. A právě PFO je jeden z klíčových enzymů v metabolismu hydrogenosomů Trichomonas vaginalis, sexuálně přenosného parazita člověka. PFO T. vaginalis je velmi důležitý enzym i co se lékařského významu týče. PFO je dle všeobecně přijímaného konceptu jeden z klíčových enzymů vystupující při aktivaci antimikrobiálních léčiv proti trichomoniáze 5-nitroimidazolů, mezi které patři i metronidazol. V genomu T. vaginalis bylo identifikováno celkem sedm PFO genů, které...
|
|
|
Anthelmintic and other xenobiotic biotransformation in helminths and its contribution to resistance development
Prchal, Lukáš ; Szotáková, Barbora (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent) ; Kučera, Radim (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát Mgr. Lukáš Prchal Školitel prof. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. Název disertační práce Biotransformace anthelmintik a jiných cizorodých látek u helmintů a její přispění k rozvoji resistence Parazitičtí helminti jako jsou tasemnice, motolice nebo oblí červi představují hrozbu pro hospodářská, domácí i volně žijící zvířata. Způsobují jim značné zdravotní problémy a chovatelům působí ekonomické ztráty kvůli poklesu produkce a nákladům na léčbu. Léčba veterinárními anthelmintiky je základní metodou boje proti helmintózám. Ovšem dlouhodobé používání anthelmintik vedlo k vývoji lékové rezistence helmintů. Největším problémem je pak rostoucí výskyt multirezistentních kmenů u řady druhů helmintů. Výzkum mechanismů lékové rezistence helmintů se tak stal velmi aktuálním směrem vědeckého výzkumu. Zvýšená biotransformace anthelmintik, urychlení jejich transportu z těl helmintů či kontakt nižších vývojových stádií helmintů s anthelmintiky v životním prostředí jsou jedny z možných mechanismů přispívajících ke snížení účinnosti farmakoterapie a k rozvoji rezistence. Předložená disertační práce se zaměřuje na studium těchto mechanismů u tří druhů helmintů. Při analýzách léčiv a jejich metabolitů bylo využíváno vysoce...
|
|
|
Mechanismy rezistence k metronidazolu u bakterií a anaerobních eukaryot
Pilařová, Kateřina ; Hrdý, Ivan (vedoucí práce) ; Kulda, Jaroslav (oponent)
Tato práce se snaží popsat mechanismy rezistence k metronidazolu u různých skupin organismů, na jejichž léčbu se metronidazol používá. Jsou to jak bakterie (rody Bacteroides, Helicobacter, Clostridium), tak anaerobní eukaryota (rody Trichomonas, Tritrichomonas, Entamoeba, Giardia). Důležité je to, že metronidazol působí selektivně pouze na buňky žijící v anaerobním nebo mikroaerofilním prostředí. Do buňky se metronidazol dostává pasivní difuzí a je poté redukován na cytotoxický meziprodukt, který poškozuje buňku na různých úrovních. U buněk s aerobním metabolismem sice dojde k průniku léčiva do buňky, může dojít i k redukci metronidazolu, eventuální radikál je pak ale v tzv. jalovém cyklu díky přítomnosti kyslíku přeměněn zpět na metronidazol. Z kyslíku pak vzniká superoxid, O2-. U anaerobů či mikroaerofilů k takto kyslíkem podmíněné detoxifikaci nitroradikálu nedochází a tak vyvinuli jiné způsoby, jak buňku ochránit před jeho škodlivými ůčinky. Vnímavost těchto patogenů k metronidazolu koreluje se změnami v jejich enzymatickém složení. Asi nejzákladnější mechanismus, jak patogeni bojují proti metronidazolu, je zamezení redukce metronidazolu. To, jakým způsobem organismy zamezují redukci, se druh od druhu liší. Je tu vzájemný vztah mezi rezistencí k metronidazolu a neefektivní aktivací antibiotika, což...
|
|
|
Purifikace rekombinantních proteinů pomocí afinitní chromatografie
Zemek, Ondřej ; Mácha, Jaroslav (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
Izolace a purifikace rekombinantních proteinů je základním předpokladem pro studium jejich strukturních a funkčních vlastností. Mezi nejdůležitější metody, které jsou k tomuto účelu využívány patří afinitní chromatografie. V této práci jsou shrnuty v literatuře publikované vlastnosti a zkušenosti s využitím nejpoužívanějších afinitních tagů. Zde probrané tagy zahrnují:CBP, MBP, GST, polyhistidinové a polyargininové tagy, FLAG-tag, Strep-tag II a SpA a některé jejich modifikace. U jednotlivých tagů je probrán jejich původ a vlastnosti, vliv na formu a lokalizaci fúzního proteinu, způsob jeho vazby a eluce ze substrátu a možnosti jeho odstranění nebo využití v jiných metodách. Klíčová slova: afinitní chromatografie, rekombinantní protein, purifikace, afinitní tag
|
|
|
Vliv parazita Toxoplasma gondii na produkci hlavních močových proteinů u myši domácí
Hladovcová, Denisa ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
MUP (hlavní močové proteiny, angl. Major Urinary Proteins) jsou feromonové přenašeče zapojené do chemické komunikace u myši domácí (Mus musculus). Komplexy MUP s ligandy zprostředkují informace o genetickém pozadí jedince a spoluvytvářejí individuální pachový profil. Jsou významné při určování příbuznosti, zásadního faktoru při volbě reprodukčního partnera. Předpokládá se, že produkce MUP je vlivem tlaku pohlavního výběru energeticky náročná a vysílaný signál je upřímný (angl. honest). Tato teorie zatím nebyla experimentálně prokázána, stejně jako vliv dalšího silného selekčního tlaku - infekce parazity. Ve své práci jsem sledovala vliv infekce parazitem Toxoplasma gondii na produkci MUP. Z výsledků vyplývá, že dochází ke změně produkce u infikovaných zvířat obou pohlaví. U samců množství MUP klesá na úroveň kastrovaných samců (respektive kontrolních samic). Z podrobnější analýzy průběhu infekce usuzujeme, že energetická náročnost tvroby MUP neumožňuje jejich produkci v první fázi infekce v běžné míře, protože energie je přednostně směřována do boje s infekcí. Částečný nárůst produkce v pozdější fázi si vysvětlujeme důležitostí pachové komunikace. Snížení hladiny MUP u nemocného zvířete by mohlo přispívat k jeho tolerování ve společnosti ostatních jedinců. Infekce měla negativní vliv nejen na...
|
|
| |
host ::
RSS.