|
|
Role jaderných laminů a Nup358 v infekci polyomavirem BK
Išler, Lukáš ; Bruštíková, Kateřina (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Lidský polyomavirus BK (BKPyV) již dlouhá desetiletí způsobuje závažné zdravotní komplikace zejména imunokompromitovaným jedincům. Cílem této práce se bylo zaměřit jednak na průběh infekce BKPyV v lidských buňkách, tak také na vliv BK virové infekce na jadernou laminu a proteiny jaderného póru (NPC; Nuclear Pore Complex). Při charakterizaci a porovnání infekce BKPyV v buňkách RPTEC/hTERT1 a MRC- 5 jsme ukázali, že replikace BKPyV probíhá lépe a dosahuje 6x vyššího virového titru v buňkách RPTEC/hTERT1. Při použití konfokální mikroskopie jsme v průběhu infekce BKPyV nepozorovali tvorbu narušení jaderné laminy, ani akumulaci proteinu VP1 pod jadernou laminou, jak bylo dříve pozorováno při infekci myším polyomavirem. Ověřili jsme předešlé pozorování cytoplazmatických deposit NPC, které se vyskytovaly v kolokalizaci s proteinem VP1 24 hodin po infekci (hpi) BKPyV a ukázali, že složkou těchto deposit vyskytujících se v kolokalizaci s VP1 je Nup358, protein NPC. Transientní exprese vektorů kódujících pozdní oblast genomu BKPyV (pEF- BKV-late) či samotný protein VP1 (pIaW) ani analýza exprese LT antigenu nenaznačily, že by se jednalo o jev způsobený produktivní infekcí. Pseudoinfekce buněk RPTEC/hTERT1 VLP odvozenými z BKPyV naopak indukovala tvorbu cytoplazmatických shluků VP1, v 33 % případů i...
|
|
|
Interakce hlavního kapsidového proteinu polyomavirů s jadernými laminy
Žáčková, Sandra ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Tato práce se soustředí na studium interakcí virových strukturních proteinů myšího polyomaviru (MPyV) a BK viru se strukturou jaderné laminy. Cílem bylo objasnit, zda a případně jakým způsobem virus, potažmo virové strukturní proteiny, interagují s jadernou laminou a jak tyto interakce ovlivňují její vlastnosti. Předpokládali jsme, že exprese virových proteinů bude indukovat rozrušení struktury jaderné laminy, které následně umožní únik virionů z jádra v závěrečné fázi infekce. Strukturní proteiny MPyV byly exprimovány z expresního vektoru pMPyV LATE, který zajistil lokalizaci virového proteinu VP1 podobnou jako u infikovaných buněk - převážně v perinukleárních oblastech jádra. Zároveň v těchto buňkách byly nalezeny defekty v barvení jaderné laminy indikující její narušení tak, jak je tomu v buňkách infikovaných MPyV. Pro experimenty jsme používali ještě expresní vektor pMPyV mut3 VP1 kódující mutovaný protein VP1. Při transientní expresi v buňkách vykazoval mutovaný protein VP1 sice difúzní jadernou lokalizaci, ale pozorovali jsme výrazné deformace a poruchy barvení jaderné laminy, které naznačují významnou roli proteinu VP1 ve změnách vlastností jaderné laminy v infikovaných a transfekovaných buňkách. Zjistili jsme, že největší množství proteinu VP1 v buňkách po transfekci pMPyV LATE a v pozdní...
|
|
|
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Horníková, Lenka
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1,...
|
|
|
Role acetylace proteinů v životním cyklu Polyomavirů
Dostalík, Pavel ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Virová částice myšího polyomaviru je složená ze 3 strukturních proteinů: majoritní strukturní VP1 a minoritní strukturní ů ci řady proteinů mohou ovlivňovat jejich posttranslační modifikace. Tato práce se zaměřuje na to jaký dopad mají acetylace strukturních proteinů na replikační cyklus MPyV. První část této práce se zabývá acetylací proteinu VP1. Podařilo se nám prokázat, ž tento protein acetylovaný ve virové čá é to, že proces acetylace je závislý na přítomnosti minoritních proteinů aké se nám podařilo prokázat, že pro infektivitu viru je důležitá HDAC6 ejí nadprodukce snižuje infektivitu viru, stejný efek é u viru izolovaného z HDAC6 KO buněk. Naše data naznačují že VP1 protein je substrátem HDAC6. Podařilo se nám zjistit, že VP1 protein viru izolovaného z HDAC6 KO buněk íce acetylovaný ve srovnání s původním vire Ve druhé čá ěřili na N' terminální acetylace proteinu na jeho N' konci byla už dříve popsána a jeho mutace zabraňující této acetylaci vede tomu, že e takový MPyV neinfekční. Proto jsme chtěli zjistit, zda je N' terminální důležitá pro stabilitu VP3 proteinu. Naše předběžné výsledky naznačují, že N' terminálně acetylovaný VP3 divokého typu je stabilnější ve srovnání s Klíčová slova: Myší polyomavirus, HDAC6, acetylace, strukturní proteiny, posttranslační
|
|
|
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Horníková, Lenka
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1,...
|
|
|
Příprava chimerických VLP myšího polyomaviru nesoucích epitopy maligního melanomu
Kojzarová, Martina ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Tachezy, Ruth (oponent)
Hlavní kapsidový protein virů z čeledi Polyomaviridae je schopen samovolně se uspořádat do viru podobné částice (virus-like particle, VLP), a to i bez přítomnosti minoritních proteinů, nespecificky vázat cizorodou DNA a rozpoznat receptor na povrchu buňky. Tyto vlastnosti ho předurčují k použití coby vektoru v genové terapii nebo imunoterapii. Už dříve bylo zjištěno, že VLPs myšího polyomaviru výrazně stimulují imunitní systém a mají silný adjuvantní účinek. Chimerické VLPs odvozené od myšího polyomaviru nesoucí cizorodý antigen či epitop by podle našich předpokladů po imunizaci měly vyvolat přesně cílenou odpověď imunitního systému. Hlavní překážkou je volba imunogenu dostatečně silného k vyvolání adekvátní imunitní odpovědi. Cílem této práce bylo za pomoci metod genového inženýrství zkonstruovat chimerické částice nesoucí na svém povrchu epitop maligního melanomu, který je znám jako jeden z nejimunogennějších nádorů. Pro účely budoucího výzkumu imunogenních účinků těchto částic byly zkonstruovány tři typy VLPs. Jednalo se o částice nesoucí epitopy lidského melanomu, další obsahující epitop melanomu myšího a kontrolní částice s ovalbuminovým epitopem. K účelům produkce chimerických proteinů byl použit bakulovirový expresní systém. Elektronovou mikroskopií bylo ověřeno, že vnesením nádorového...
|
|
|
Analýza životního cyklu BK viru
Bakardjieva - Mihaylova, Violeta ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Mindlová, Martina (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry, jejichž replikace probíhá v buněčném jádře. I přes svoji malou genomovou velikost mohou tyto viry způsobit výrazné změny v hostitelské buňce, jednou z nejvýznamnějších je nádorová transformace. Většina studií lidských patogenů z této čeledi je středem zájmu klinických výzkumů, které však neposkytují dostatek informací o jednotlivých událostech životního cyklu virů. Tato práce se hlavně zabývá přesným určením doby kdy dochází ke vzniku jednotlivých virových produktů a vytvořením časového sledu událostí během infekce v přirozených buňkách, které jsou cílem pro BKV v lidském organizmu. Bylo zjištěno, že časový průběh životní cyklus BKV se velice podobá těm pro modelové polyomaviry MPyV a SV40 a v permisivních buňkách trvá přibližně 40 - 50 hodin.
|
|
|
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Horníková, Lenka ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1,...
|
host ::
RSS.