|
|
Fluorescenční korelační spektroskopie ve studiu vlastností koloidních systémů
Marková, Kateřina ; Lehocký, Marián (oponent) ; Kapusta, Peter (oponent) ; Pekař, Miloslav (vedoucí práce)
Hydrogely jsou pro své vlastnosti vyhledávanou matricí pro medicínské účely. Často jsou tyto vlastnosti podmíněné jejich strukturou, proto je kladen důraz na přesně definovanou polymerní síť. Vrámci předložené dizertační práce byly různé typy hydrogelů zkoumány pomocí fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) ve spojení smikroreologií. Spojení těchto metod se při zjišťování vlastností hydrogelů využívá minimálně, proto byla potřeba standardizace aoptimalizace metody. Pro tyto účely byly vybrány fluorescenčně značené silikátové nanočástice sneutrálním povrchovým nábojem. Vrámci optimalizace metody byly zjištěny limity přístroje, kdy se naměřené difúzní koeficienty ještě daly považovat zavalidní. Dále byly určeny parametry, které ovlivňují MSD křivku, tedy mají vliv také nasprávnost samotných naměřených dat. Jako modelový koloidní systém byl vybrán vodný roztok agarózy, který se vzávislosti nakoncentraci pohybuje vrozmezí viskoelastické kapaliny, až po tuhý hydrogel. Na něm byly testovány difúzní vlastnosti použitých nanočástic, ale také strukturní vlastnosti samotného systému. Byly zjištěny limitní koncentrace, kdy difúzní koeficient přestal být vybranou technikou detekovatelný. Tento limit se podařilo částečně posunout úpravou korelačního času, kdy ovšem rozptyl hodnot difúzního koeficientu byl velmi vysoký. Takto naměřené hodnoty byly srovnány sbezkalibrační metodou dvouohniskové fluorescenční korelační spektroskopie (2f-FCS). Dále byly zjišťovány změny vdifúzním koeficientu vzávislosti na typu přípravy vzorků. Současně stěmito experimenty byla provedena i obrazová analýza, která ve spojení sFCS přinesla zajímavé výsledky. Posledním experimentem, který přinesl informace o vlastnostech jak vložených nanočástic, tak polymerním systému, bylo vymývání částic ze struktury hydrogelu. Jako poslední a nejpokročilejší analýza polymerní sítě, která definovala systém novým, alternativním, způsobem, byla vybrána metoda maximální entropie a analýza pomocí log-normální distribuce difúzních koeficientů. Hodnoty získané těmito pokročilými analýzami byly podobné jako data vypočítaná matematickým modelem anomální difúze. Novým přístupem byl popis vlastností pomocí reologických modulů. Ty se získaly řadou přepočtů znaměřené autokorelační křivky. Výstupem byl tedy reologický modul získaný zmikroreologických dat. Tvar křivky je srovnatelný sklasickou (makro)reologií, nicméně číselné hodnoty jsou řádově nižší. Nejmenší částice se vcelé koncentrační řadě chovaly jako včistě viskózním prostředí, největší částice definovaly chování systému vzávislosti nakoncentraci od velmi viskózního po viskoelastické. Posledním typem měření bylo studium hyaluronanu pomocí vybraných nanočástic a dále pomocí jeho fluorescenčně značeného analogu. Veškeré metody, které byly použity ve studiu agarózového hydrogelu se aplikovaly na viskoelastický systém hyaluronanu, kdy se zjišťovala použitelnost vybraných metod pro nový koloidní systém.
|
|
|
Studium doby života a spektrálních změn fluorescence nanočástic v buněčné biologii
Pelc, Pavel ; Janoušek, Oto (oponent) ; Čmiel, Vratislav (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá studiem doby života a spektrálních změn fluorescence nanočástic v buněčné biologii. Popisuje princip fluorescence, fluorescenční mikroskopii a laserový konfokální mikroskop Leica TCS SP8. Je zde přiblížena klasická metoda FLIM, mapování Lambda Square a rozdělení nanočástic. V praktické části je popsán realizovaný program pro hodnocení doby života fluorescence a spektrálních změn. Program umožňuje zobrazovat excitačně-emisní lambda mapy, dobu života fluorescence a spektrální posun v prostorové oblasti. V závěru práce je proveden experiment s rhodaminovými nanočásticemi, který je pomocí realizovaného programu vyhodnocen a diskutován.
|
|
|
Analýza fluorescence organického barviva s využitím konfokální mikroskopie
Mocko, Štefan ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Čmiel, Vratislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá dlouhodobou analýzou fluorescence rhodaminu, který je navázán na železité SPIO nanočástice. V první části seznamuje s nutným vědeckým základem pro pochopení fyzikálního jevu fluorescence. Dále se zaměřuje na použité hardwarové a softwarové vybavení pro dlouhodobou analýzu vývoje fluorescence u mezenchymálních kmenových buněk. V neposlední řadě je zde popsán analytický software pro práci s naměřenými daty, který byl vyvinut pro tuto práci.
|
|
|
pH citlivé fluorescenční sondy
Marková, Kateřina ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Cílem této práce bylo navrhnout vhodnou metodu pro měření pH bakteriálního cytosolu v bakteriích kmene Cupriavidus necator. Pro získání skenu bakterií byla zvolena fluorescenční mikroskopie a časově rozlišené fluorescence pro získání kalibrační křivky. Nejideálnější sondou, kterou bylo možno využít, byl BCECF-AM. Bylo navrženo, že pro prokaryotický typ buněk je vhodnější použít externí kalibraci než interní. Bakterie s označením H16 vykazují dlouhou dobu života pouze na granulích s obsahem PHB, zatímco u bakterií typu PHB-4 se nejdelší doba života vyskytuje náhodně v celé buňce.
|
|
|
Vnitřní fluorescence bakterií Cupriavidus necator
Marková, Kateřina ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá autofluorescencí flavinů v gram-negativní bakterii Cupriavidus necator H16 a jejím mutantním kmenu PHB-4. Experimenty byly prováděny pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie. Pro potvrzení přítomnosti flavinů byla změřena excitační a emisní spektra bakteriální suspenze, která se porovnala s flavinovými standardy. V části věnované testování buněk bez stresové odpovědi se měřila autofluorescence bakterií v PBS pufru a buněčné suspenze obarvené fluorescenční sondou BODIPY 493/503. Byl porovnáván poměr krátké doby života ku dlouhé době života autofluorescence a jeho závislost na přítomnosti fluorescenční sondy. Dále byla měřena autofluorescence supernatantu, kdy bylo zjištěno, že relativní zastoupení dlouhé doby života v extracelulárním prostředí je mnohonásobně vyšší než v intracelulárním. V části věnované stresové odpovědi se práce zaměřila na množství rozpuštěného kyslíku v produkčním médiu. Dále byl použit různě koncentrovaný peroxid vodíku, kdy nejlepší výsledky vykazovala koncentrace 100 mM. Pro porovnání s předchozími podmínkami se využila kombinace se síranem železnato-amonným, kde ale nebyl pozorován žádný rozdíl. Z látek ovlivňujících přímo dýchací řetězec byl použit azid sodný a antimycin A. Obě tyto látky měly vliv na změnu poměru relativního zastoupení dob života autofluorescence, ovšem rozložení těchto dob života a změnu rozložení autofluorescence v průběhu času ovlivňoval pouze azid sodný.
|
|
|
Hodnocení doby života a změn konfokální mikroskopií
Rúbal, Radek ; Janoušek, Oto (oponent) ; Čmiel, Vratislav (vedoucí práce)
Práce se zabývá technikami pro zobrazení doby života fluorescence. Doba života fluorescence je počítána z dat získaných pomocí sekvenčního snímání konfokálním mikroskopem Leica TCS SP8X . V práci jsou uvedeny algoritmy výpočtu a software pro zobrazení a analýzu doby života fluorescence jak ve 2D tak ve 3D. Na konci jsou postupy použity pro zobrazení doby života fluorescence mezenchymálních buňek a fibroblastů obarvených komplexem SPIO-Rhodamine.
|
|
|
Korelace mezi měřením stacionární fluorescenční anisotropie na fluorimetru a fluorescenčním mikroskopu
Moslerová, Lenka ; Venerová, Tereza (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá studiem fluorescenční anizotropie na modelovém systému fluorescenční sondy a glycerolu. Fluorescenční látkou je v této práci použito ATTO 488 a jako modelové prostředí byly použity roztoky glycerolu o různých koncentracích k nasimulování různě viskózních prostředí. Měření bylo prováděno na fluorescenčním spektrofluorimetru a na konfokálním fluorescenčním mikroskopu. Byla pozorována lineárně se zvyšující naměřená hodnota anizotropie v závislosti na jednotlivých viskozitách jak u hodnot naměřených na fluorimetru, tak se stejným trendem zvyšující hodnot naměřených na fluorescenčním mikroskopu. Tyto hodnoty byly porovnány a byly stanoveny korekční faktory. Díky Perrinově rovnici bylo výpočtem ověřena správnost měření.
|
|
|
Softwarové řešení systému FLIM s využitím pulsního laditelného laseru v konfokální mikroskopii
Grund, Pavel ; Odstrčilík, Jan (oponent) ; Čmiel, Vratislav (vedoucí práce)
Teoretická část této diplomové práce je zaměřena na rešerši konfokální mikroskopie a na metodu FLIM. Rozvádí principy a druhy konfokální mikroskopie a využití širokospektrálního laseru, jakožto základního zdroje světla u těchto mikroskopů. Přiblíží, co je to metoda FLIM a její využití nejen v buněčné biologii. Praktická část diplomové práce zahrnuje pořízení tří sad fluorescenčních intenzitních snímků s využitím aplikace pulsního laditelného laseru, funkce TimeGate a detekce hybridními detektory. Pro praktické zpracování této diplomové práce je v softwarovém prostředí Fiji vytvořen plugin, což je zdrojový kód v programovacím jazyku Java. Typy pluginů a jejich použití jsou popsány ve třetí kapitole práce. Tento plugin včetně grafického uživatelského prostředí ve formě dialogového okna zpracovává fluorescenční intenzitní snímky a vytváří z nich grafickou reprezentaci dat znázorňující dobu života fluorescence, tzv. pseudobarevnou mapu.
|
|
|
Možnosti systému FLIM v konfokální mikroskopii
Petrula, Jakub ; Odstrčilík, Jan (oponent) ; Čmiel, Vratislav (vedoucí práce)
Táto práca sa zaoberá využitím systému FLIM v konfokálnej mikroskopií. Popisuje základné pojmy, ktoré úzko súvisia s danou témou, ako je princíp fluorescencie, fluorescenčné značenie a podstata fluorescenčnej a konfokálnej mikroskopie. Praktická časť sa venuje práci s konfokálnym mikroskopom, na ktorom je zaobstaraná sada intenzitných snímkov rastlinnej a živočíšnej bunky. Konečným produktom praktickej časti bakalárskej práce sú snímky, na ktorých je v pseudofarbách vyobrazená doba života fluorescencie. V práci je tiež popísaný algoritmus k vytvoreniu pseudofarebných snímkov. K algoritmu je vytvorené uživateľské prostredie.
|
|
|
Studium UV světlem generovaných fluorescenčních komplexů zinku pomocí fluorescenční spektroskopie
Havlíková, Martina ; Vaculovičová, Markéta (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá studiem UV světlem generovaných fluorescenčních komplexů zinku s kadmiem a organickými molekulami SAM, SAH, CYS, HCYS a GSSG, konkrétně při vlnové délce 375 nm. Dále je cílem práce prekurzory spektrálně a temporálně charakterizovat před a po ozáření v transiluminátoru při vlnové délce 250 nm. Studium geneze fluorescenčních komplexů bylo provedeno pomocí metody FLIM. Díky této metodě bylo zjištěno, že ke tvorbě zmiňovaných komplexů dochází jen u prekurzorů Zn:SAH, Zn:GSSG a Zn:Cd, a že na tuto tvorbu má značný vliv způsob přípravy. Spektrální charakteristika byla provedena na fluorimetru, kde byl očekáván nárust intenzity fluorescence u ozářeného roztoku s prekurzory. Jednalo se o zakalené roztoky, kde byla pozorována sedimentace částic, se kterou docházelo ke změně intenzity fluorescence. U vzorku Zn:SAM a Zn:CYS docházelo se sedimentací ke zvýšení intenzity, naopak u Zn:SAH a Zn:HCYS docházelo k jejímu snížení. Roztok s prekurzory Zn:Cd byl čirý, a tak nedocházelo k žádné změně intenzit. Zn:Cd vykazoval nejlepší spektrální vlastnosti, naopak nejhůře se jevil vzorek se Zn:SAM, jehož excitační a emisní maxima se nacházejí velmi blízko sebe. Vzorek s prekurzory Zn:CYS a Zn:HCYS vykazoval téměř stejné výsledky spekter a příslušných maxim. Na základě charakteristiky dle dob života metodou TCSPC se nejlépe choval vzorek se Zn:CYS, Zn:HCYS a Zn:GSSG, které vykazovaly 3 doby života. U vzorku se SAM a SAH nebylo možné jednoznačně určit doby života. Zn:Cd vykazoval 4 doby života.
|
host ::
RSS.