|
|
Genová exprese v kuřecím embryu: mikromanipulační a vizualizační metody
Bendová, Michaela ; Dvořák, Michal (vedoucí práce) ; Hirsch, Ivan (oponent) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Cílem této dizertační práce bylo získat lepší vhled do principů vývoje buněčných struktur a orgánů v kuřecím embryu. K tomuto účelu byly zavedeny a k daným procedurám upraveny různé pokročilé metody manipulace a vizualizace in vitro, ex vivo, ex ovo a in ovo. Tyto specializované metody byly využity zejména ke studiu genové exprese ve vývoji neurální lišty a vývoji oka. Během dlouhodobého výzkumu v naší laboratoři byl pozorován vliv onkoproteinu v-Myb na vývoj neurální lišty a jeho schopnost měnit přirozený buněčný osud. Studovali jsme vliv proteinu v-Myb na změny v diferenciaci buněk neurální lišty, zejména jejich vývoj do melanocytární linie, a jeho vliv na expresi genů v neurální liště. Středem našeho zájmu se stal protein Gremlin 2, označovaný také jako PRDC (protein related to Dan and Cerberus), jehož expresi v-Myb v neurální liště zvyšuje. Zavedené postupy elektroporace neurální lišty in ovo byly upraveny pro transfekci buněk vyvíjejícího se oka a využity ke studiu genové regulace při indukci čočky. Výsledky získané na kuřecím modelu podpořily studii provedenou na myších embryích. Technika elektroporace do embryonálního oka byla také upravena pro mikromanipulace s retinou in ovo, která byla dále zpracována metodami ex vivo a in vitro pro studii zabývající se lokalizací snRNP ve...
|
|
|
Vliv alelických variant transportéru ABCG2 na transport kyseliny močové
Vávra, Jiří ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Ježek, Petr (oponent)
Kyselina močová je u člověka a vyšších primátů hlavním metabolitem vznikajícím degradací purinů. Její zvýšená hladina v séru, tzv. hyperurikemie, může být příčinou vzniku dny a dalších souvisejících chorob. Pro řízení urikemie mají vliv četné transportní proteiny, které se nacházejí v epitelu proximálního tubulu ledvin. Při poruše činnosti některého z nich může tedy být narušena hladina kyseliny močové v krvi. Celogenomovými GWAS studiemi bylo zjištěno, že často bývá při těchto patologických stavech postihnut transportér ABCG2, který se za normálních okolností podílí na secernaci kyseliny močové do moči. Cílem práce je, na modelu nematurovaných oocytů žáby Xenopus laevis, ověřit in vitro schopnost alelických variant ABCG2 přenášet kyselinu močovou. Tyto alelické varianty pocházejí z celogenomových studií provedených Revmatologickým ústavem při 1.LF v Praze. Transport kyseliny močové bude srovnán s wild type variantou transportéru. Klíčová slova: Kyselina močová, GWAS studie, Xenopus Laevis, membránové transportéry, ABCG2
|
|
|
Genetics and molecular basis of spina bifida
Kim, Alice ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Hovořáková, Mária (oponent)
Spina Bifida patří mezi vady vznikající během neurulace, konkrétně při uzávěru neurální trubice. Neurální valy nejčastěji v bederní oblasti nefúzují a zůstává zde otvor. Recentní studie naznačují, že naše chápání tohoto procesu, tj., že uzavírání neurální trubice probíhá nezávisle na několika místech, by mohlo být chybné a akcentují iniciaci z jednoho bodu. K vytvoření Spina bifida vedou různé faktory, jako je výživa, genetické predispozice a prostředí. Kyselina listová a vitamin B12 se ukázali jako účinné doplňky stravy, pokud jde o snížení rizika vzniku této vady. Z genetického pohledu, mutace v genech MTHFR, CUBN, CHKA, SARDH, MTRR, Grhl-3, které jsou zapojeny v procesu methylace, jsou považovány za důležité rizikové faktory pro vznik Spina bifida u člověka. V rámci myšího modelu byla prokázána role nesprávné methylace nebo hypomethylace Hox a Vangl genů. V neposlední řadě tuto vadu způsobují taktéž mutace v genech Par1 / Par2.. Neurální valy v daném místě nefúzují a zůstává zde otvor. Recentní studie naznačují, že naše chápání tohoto procesu, tj., že uzavírání neurální trubice probíhá nezávisle na několika místech, by mohlo být chybné a akcentují iniciaci z jednoho bodu. K vytvoření Spina bifida vedou různé faktory, jako je výživa, genetické predispozice a prostředí. Kyselina listová a vitamin B12 se...
|
|
|
Buněčná a molekulární podstata regenerace kůže u obojživelníků a savců
Hybešová, Michaela ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Jendelová, Pavla (oponent)
Hojení poraněné kůže u savců a její regenerace u obojživelníků patří mezi významná biomedicínská témata v rámci posledních pár desetiletí. Nejdůležitějším aspektem u člověka je tvorba jizvy a snaha o její nahrazení funkční diferencovanou tkání. K modulaci mechanismů tvorby jizvy je třeba porovnat tento proces s regeneračními mechanismy u obojživelníků, kde dochází k obnově původní tkáně a funkčnosti. Hlavním modelem pro studium regenerace jsou mloci, kteří si tuto schopnost zachovávají po celý život. Na druhou stranu žáby o tuto vlastnost přicházejí s metamorfózou, i když ne zcela. Imunitní systém žab po metamorfóze se shoduje s tím u savců. Podobně přechod z časného embryonálního vývoje u savců, kde byl plod schopen kompletní regenerace poškozené tkáně, na dospělý typ hojení, jde také ruku v ruce s rozvojem imunitního systému a strukturní diferenciace poškozené tkáně. Klíčovými faktory, které rozlišují proces hojení s jizvou a bez jizvy, jsou tak zánětlivé buňky a jejich regulace, tvorba ECM včetně proliferace fibroblastů, a produkce příslušných cytokinů.
|
|
|
Molekulární podstata penetrace spermií a jejich membránové fúze s oocytem v rámci oplození u savců
Klimková, Veronika ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Frolíková, Michaela (oponent)
Oplození je proces skládající se z mnoha kroků, které na sebe musejí navazovat a doplňovat se. Spermie jsou schopny oplození až po kapacitaci, hyperaktivaci a po spuštění akrozomální reakce. Vajíčka obklopená kumulárními buňkami naopak vysílají signály k aktivaci a orientaci spermií. Tato práce je zaměřena na nejnovější poznatky rolí kumulárních buněk, tedy tvorbu chemoatraktivních látek a zdali kumulární buňky spouštějí akrozomální reakci po navázání nově objeveného proteinu NYD-SP8. Zdá se, že progesteron indukuje akrozomální reakci a že je nejlepším chemoatraktantem vylučovaným kumulárními buňkami. Dále se zde zabývám fúzí cytoplazmatických membrán spermie a vajíčka, kde jsou potřebné povrchové proteiny jako je Juno a IZUMO1. Klíčová slova: fúze membrán, kumulární buňky, akrozomální reakce, chemotaxe, spermie, vajíčko, oplození
|
|
|
The study of Xenopus tropicalis testis-derived stem cells
Nguyen, Thi Minh Xuan ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Bartůněk, Petr (oponent) ; Hovořáková, Mária (oponent)
Studium kmenových buněk odvozených z varlat Xenopus tropicalis Nguyen Thi Minh Xuan Abstrakt Sertoliho buňky (SCs) produkují celou řadu molekul klíčových pro determinaci samčího pohlaví a pro regulaci spermatogeneze v dospělosti. Poruchy diferenciace Sertoliho buněk vedou u člověka ke sterilitě. Před nástupem puberty hrají důležitou roli v udržení spermatogoniálních buněk v kmenovém stavu a zajišťují tak jejich dostatečný počet. Zajímavým znakem odlišujícím nezralé a zralé Sertoliho buňky je dočasná přítomnost cytokeratinu, který byl u těchto buněk popsán u celé řady modelových organismů. V rámci této disertační práce jsme se zabývali rozdílnou genovou expresí proteinů spojených s regulací cytokeratinu u nezralých a zralých Sertoliho buněk odvozených z varlat Drápatky tropické (Xenopus tropicalis). Imunohistochemické řezy varlat z juvenilních jedinců a imunocytochemická analýza buněčné kultury odvozené ze stejného zdroje, obsahující nezralé progenitory Sertoliho a peritubulárních myoidních buněk (XtiSC) ukázaly na společnou expresi cytokeratinu a membránového β-kateninu. V případě vzorku z dospělých jedinců nebyla detekována přítomnost ani jednoho z nich. Dále pak podobný fenotyp vykazovaly i migrující Sertoliho buňky (pre- SCs), které se nacházely mimo semenotvorné kanálky. I zde byla exprese obou proteinů...
|
|
|
Vliv ubiquitinace spermií v rámci časného embryonálního vývoje prasete
Petelák, Aleš ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Šušor, Andrej (oponent) ; Procházka, Radek (oponent)
Dizertační práce se zabývá vlivem extracelulárního ubiquitinu na úspěšnost časného embryonálního vývoje a dále pak možnostmi, jak zlepšit podmínky pro umělé oplození pomocí inkubace oocytů s regulátory činnosti iontových kanálů. Pro potřeby tohoto výzkumu byla zavedena zcela nová metodika na třídění spermií pomocí průtokové cytometrie a jejich následnou kryoprezervaci. Byly ustanoveny podmínky pro úspěšné třídění spermií na základě míry extracelulární ubiquitinace, které poskytují vysokou specifitu selekce a zároveň dostatečný počet viabilních spermií pro oplození metodou ICSI. Pro následnou kryoprezervaci poměrně velmi nízkého počtu spermií jsme dokázali optimalizovat již zavedené metody tak, aby bylo možné zamrazovat minimální objem spermiové suspenze i s malým počtem buněk. Následný experiment prokázal přímou souvislost mezi mírou extracelulární ubiquitinace a schopností spermií vytvořit správně se vyvíjející embryo. Spermie, u kterých bylo detekováno velké množství extracelulárně vázaného ubiquitinu, byly signifikantně méně úspěšné z pohledu následného vývoje embrya do stádia blastocysty po ICSI než ty, které vykazovaly nízkou úroveň povrchové ubiquitinace (6,2 vs. 16,7 %, P<0,001). Míra extracelulární ubiquitinace neměla vliv na úspěšnost rýhování embrya, ale souvisela s ní úspěšnost...
|
|
|
Transdiferenciace somatických buněk do hepatocytů a klinicky relevatní editace genu Tight junction protein 2
Fryntová, Lucie ; Janečková, Lucie (vedoucí práce) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Transdiferenciace v buňce indukuje strukturní přestavby chromatinu a epigenetické změny, které ovlivňují spektrum genové exprese a způsobují celkovou remodelaci buňky. Během transdiferenciace dochází k přímé konverzi určité zralé linie somatických buněk na zralou buněčnou linii jiného typu, napříč jednotlivými zárodečnými vrstvami. Diplomová práce byla zaměřena na transdiferenciaci mezenchymálních buněk - myších embryonálních fibroblastů na endodermální buňky - hepatocyty in vitro s použitím kombinace transkripčních faktorů Hnf4α a Foxa1. Mapování přeměny fibroblastů bylo zahájeno bezprostředně po vyvolání konverze a definitivní vznik tkáňové kultury indukovaných hepatocytů byl potvrzen morfologickými a funkčními testy. Myší indukované hepatocyty nasledně sloužily pro modelaci lidského jaterního onemocnění, ilustrujícího anamnézu pacienta z Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze, u kterého nebyla možná imunohistochemická detekce proteinu z jater. Pro genetickou editaci indukovaných hepatocytů byla použita technologie CRIPSR/Cas9, při které byl nukleázou Cas9 a navigující gRNA (guide RNA) vytvořen dvouvláknový zlom v genu Tight junction proteinu 2, a následnou syntézou komplementárního řetězce podle DNA templátu byla vyvolána bodová mutace, měnící triplet aminokyseliny v cílovém...
|
|
|
Analyses of Monocercomonoides genome sizes, ploidies and karyotypes
Kornalíková, Martina ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Oxymonády jsou skupinou bičíkatých prvoků, žijících v prostředí s nízkou koncentrací kyslíku. Obývají především střeva hmyzu a obratlovců. V této studii se zaměřujeme na analýzu ploidie a karyotypu různých druhů oxymonád pomocí metody fluorescence in situ hybridizace (FISH) s použitím prób proti jednokopiovým genům a telomerickým repeticím. Také jsme se pokusili odhadnout velikost genomu těchto druhů oxymonád pomocí průtokové cytometrie. S použitím specifických FISH prób proti SufDSU genu, který je pravděpodobně přítomenv jedné kopii v genomu, ukázali, že všechny studované kmeny jsou haploidní. Z genomu Monocercomonoides exilis víme, že oxymonády mají původní typ telomerické repetice (TTAGGG). Použitím próby proti těmto telomerickým repeticím jsme se pokusili odhadnout počet chromozomů u sedmi kmenů (pěti druhů) Monocercomonoides. Kromě jedné vyjímky byl průměrný počet signálů pod 20, což naznačuje počet chromozomů v řádu jednotek. V kmenech M. mercovicensis jsme ovšem zaznamenali mnohem vyšší počet signálů naznačujících, že buňky mají mnohem vyšší počty chromozomů. Nakonec jsme stanovili obsah DNA v jádreh těchto kmenů pomocí průtokové cytometrie se standardem M. exilis PA203, jehož velikost genomu je známa (82Mbp). Výsledky ukazují, že většina kmenů má menší velikost genomu podobnou nebo menší,...
|
|
|
Úloha oxidu dusnatého (NO) v průběhu embryonálního vývoje pokožky drápatky vodní
Tománková, Silvie ; Šindelka, Radek (vedoucí práce) ; Krylov, Vladimír (oponent) ; Soukup, Vladimír (oponent)
Oxid dusnatý (NO) je zajímavá molekula účastnící se mnoha důležitých biologických funkcí jako je vazodilatace cév, neurotransmise, imunitní odpověď nebo buněčná proliferace. Tato práce ukazuje zásadní úlohu NO během embryonálního vývoje pokožky drápatky vodní. Vnější vrstva embryonální epidermis drápatky vodní je složena ze 4 typů buněk (malých sekrečních buněk, multi-ciliárních buněk, ionocytů a tzv. "goblet" buněk) a svým složením se podobá specializovaným epiteliím jako je lidský respirační epitel. Díky této podobnosti se embryonální epidermis drápatky vodní stala vhodným modelem pro studium lidských mukózních a mukociliárních epitelií a jejich defektů. Pomocí molekulárních a imunohistochemických metod bylo v rámci této práce zjištěno, že NO je produkovaný zejména ionocyty a multi-ciliárními buňkami. Studium molekulárních a buněčných změn u embryí s inhibovanou produkcí NO odhalilo nezbytnost tohoto radikálu pro správné formování a fungování mukociliárního epitelu. Inhibice NO vedla ke snížení množství specializovaných epidermálních typů (malých sekrečních buněk, ionocytů a multi-ciliárních buněk) a k zásadním strukturním změnám multi-ciliárních buněk. Ukázalo se, že NO ovlivňuje vývoj embryonální epidermis skrz kanonickou sGC-cGMP-PKG signální dráhu. Mechanismus působení NO na vývoj embryonální...
|
host ::
RSS.