|
|
Vlastnosti myších buněk, které byly modifikovány geny pro imunomodulační faktory a endostatin
Lakatošová, Monika ; Vonka, Vladimír (vedoucí práce) ; Reiniš, Milan (oponent) ; Forstová, Jitka (oponent)
Souhrn Vt6toprAcijsemzkoumalavlastnostimy3lchbun6ktransformovanfchviremHPV16'kfer6 byly genetickymodifikovfny vnesenimgent pro cytokiny' chemokin ajeden angiostaticki gen' Byly testovAnyhlavnlcharakteristikytransdukovanfchbun€kvporovnAnisrodidovkjminddorovfmi buikami in vitro a in viYo VprvnldristijsempouZilabunddnouliniidefrcientnlnabunddnoutymidinkin6zu'ozratenou jakol23IA,kter6bylaodvozenazmy5ich(c57BLl6)ledvinnjchbun€ktransformovarrjchonkogeny E6lETHPV16aaktivovanfmonkogenemH.rasomaEenlchjakoMK16.Builkyl23IAjsem transfekovala bicistronickfmi plazmidy nesoucimi geny pro herpetickou tymidin kin6zu (HSv-Tn, kostimulaini molekulu B7-,1(cD 80) nebochemokin - protein 1 chemoatrahujicimonocyty (MCP-L)' ho kontrolni idely jsem pouZilaplazmid obsahujicljen genpro I/SY-IK' Do testfijsem zahrnulatak€ diive izolovan6 bufiky Bg, kterd byly transdukov6ny geny pro faktor stimulujicl tvorbu kolonii granulocytiamonocytft(GM-cSnaHSV-TK'VSechnyizolovan6liniebylycitliv6kegancikloviru' prokazujice tak piitomnost HSV-TK. po inokulaci syngennimmystm, byly bunky exprimujici GM- CSFa B7-l neonkogenni.Po odkov6nibunEkprodukujicichMCP-I vfvofily t6m6l v5echnymy3i fl(dory. Zvl?rltaimtmizovani bunkami produkujici GM-CSF a B7-l byla chr6ndnapled n6slednou...
|
|
|
Viry a jaderný cytoskelet
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šťovíček, Vratislav (oponent)
Jaderný cytoskelet (nukleoskelet) zajišťuje strukturní integritu jádra a účastní se řady klíčových procesů včetně transkripce, remodelace chromatinu nebo transportu mRNA. Je tvořen jadernými laminy, jaderným aktinem a dalšími proteiny. Některé viry replikující se v jádře využívají jaderný cytoskelet v některých fázích životním cyklu, v jiných případech naopak může představovat pro virovou infekci překážku. Herpesviry potřebují jaderný aktin ke skládání a transportu virových kapsid. V úniku z jádra jim však brání jaderná lamina, kterou musí rozrušit. U bakulovirů se jaderný aktin také podílí na správné morfogenezi kapsid a pravděpodobně i na jejich exportu z jádra. U některých retrovirů byl ukázán transport nesestřižených RNA z jádra pomocí jaderného aktinu a existují i důkazy o jimi indukované destrukci jaderné laminy. V této práci se podrobně zabývám interakcemi virů (výše zmíněných čeledí) s jaderným cytoskeletem (konkrétně s jaderným aktinem a laminy).
|
|
|
Interference vybraných DNA virů s procesy apoptózy
Sauerová, Pavla ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Štěpánek, Luděk (oponent)
Tato práce je zaměřena na vybrané DNA viry a některé jejich mechanismy uplatňující se v inhibici či indukci procesu apoptózy. Vybranými DNA viry jsou virus hepatitidy B, polyomaviry, papilomaviry a herpesviry. Viry vyvinuly v rámci evoluce různé strategie v boji proti hostitelské obraně. Jednou z obranných odpovědí hostitele na virovou infekci je apoptóza. U virů zaznamenáváme fenomén potlačení či indukce apoptózy v závislosti na fázi životního cyklu, ve kterém se virus nachází. V některých strategiích, zasahujících do procesu apoptózy, nalézáme jisté podobnosti. Typickým příkladem je zacílení a manipulace na úrovni onkosupresoru p53 či produkce Bcl-2 homologů. Jiné strategie jsou výrazně specifické. Cílem těchto manipulací je zajištění úspěšné replikace, uvolnění viru z buňky a tedy jeho šíření organismem či mezi organismy. Některé viry dokonce disponují mechanismy, které jim umožní perzistovat v organismu po dlouhý časový úsek, nebo do konce jeho života.
|
|
|
Rekombinantní viry vakcinie pro nádorovou terapii, analyza biologickych a biochemickych vlastností.
Žůrková, Kamila ; Němečková, Šárka (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent) ; Trejbalová, Kateřina (oponent)
150 7 SOUHRN Virus vakcínie lze využít pro vyvolání imunitní reakce proti virem produkovanému heterolognímu proteinu a organismus tak připravit na obranu proti přirozenému producentu tohoto antigenu, např. viru nebo nádorových buněk. V naší laboratoři jsou vyvíjeny vakcíny proti nádorům způsobeným lidským papilomavirem typu 16 (HPV16). Používají se rekombinantní viry vakcínie odvozené z replikujícího se kmene P13 nebo atenuovaného MVA. Rekombinantní viry byly použity v profylaktických i terapeutických schématech léčby u myšího modelu nádorových buněk TC-1 či TC-1/A9. Rekombinanty exprimovaly papilomavirový onkogen E7 ve formě vysoce imunogenního SigE7LAMP fúzního konstruktu. Pro podporu imunitního systému byly do virů vloženy navíc i geny pro stimulační cytokiny GM-CSF nebo Flt3 ligand, které vykazují adjuvantní vlastnosti při vyvolání protinádorových odpovědí. Pro imunomodulaci nádorového mikroprostředí byly do rekombinantních virů vloženy geny pro solubilní receptory pro TGF-β, jejichž funkcí bylo snížit inhibiční vliv nádorového cytokinu TGF-β. Intratumorální či intraperitoneální podání virů vedlo ke zvýšení protinádorové odpovědi, u virů exprimujících Flt3 ligand také ke zvýšení počtu cytotoxických E7-specifických T lymfocytů. Exprese GM-CSF a Flt3 ligandu zabránila vzniku supresorových MDSC buněk, ale...
|
|
|
Fluorescenční studie bakteriálních membránových proteinů a buněčné signalizace.
Fišer, Radovan ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Hof, Martin (oponent) ; Forstová, Jitka (oponent)
(česky) Tato práce shrnuje pět publikací, které se zabývají převážně adenylátcyklázovým toxinem (CyaA) bakterie Bordetella pertussis a jeho interakcí s biologickou membránou. CyaA narušuje buněčné membrány tvorbou malých kationtselektivních kanálů a rozvrací buněčnou signalizaci pomocí enzymu (AC, adenylátcyklázy) přeměňujícího buněčné ATP na cAMP. První studie objasňuje mechanizmus narušování membrány v případě CyaA a příbuzného RTX toxinu, αhemolyzinu (HlyA) produkovaného Escherichia coli. K tomuto účelu byly použity lipozómy jako umělý membránový systém a fluorescenční zhášecí metoda. Oba zkoumané toxiny vykazovaly postupný únik materiálu z lipozómů a rozdílné iontové selektivity (Fišer a Konopásek 2009). Jak doprava AC domény, tak tvorba kanálů jsou závislé na vlastnostech predikovaného transmembránového αhelixu (502522). V naší práci jsme zkoumali další predikovaný transmembránový segment (565591), který nese kyselé zbytky Glu(570) a Glu(581). Většina pokusů byla prováděna na erytrocytech a planárních lipidových membránách. Zjistili jsme, že záporný náboj v pozici 570 je zásadní pro iontovou selektivitu kanálu a je patrně umístěn v blízkosti jeho ústí. Substituce v obou pozicích zásadně ovlivňují schopnost translokace AC domény...
|
|
|
Construction of various types of vaccines based on the structural proteins of mouse polyomavirus and analysis of immune response after their administration to mice
Hrušková, Veronika ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Roubalová, Kateřina (oponent) ; Reiniš, Milan (oponent)
Shrnutí Humorální a buněčná odpověď myší na intranasální aplikaci modelových polyomavirových VLPs nesoucích zelený fluorescenční protein Imunizovali jsme myši modelovými chimerickými EGFP-VLPs a studovali jsme jejich imunitní odpovědi. Detekovali jsme protilátky proti proteinu VP1, ale ne protilátky proti proteinu EGFP v sérech imunizovaných myší. Prokázali jsme produkci IL-2 a IFN u splenocytů z imunizovaných myší. Pozorovali jsme proliferaci CD4+, ale ne CD8+ T buněk, specifickou na VP1 i na EGFP. Nepodařilo se nám prokázat cytotoxickou aktivitu specifickou proti EGFP. Presentace EGFP-VLPs v souvislosti s MHC II třídy byla blokována inhibitory endolysosomálních i proteasomálních kompartmentu. Zaznamenali jsme změny v počtech CD25+Foxp3+ subpopulací CD4+ T buněk ve slezinách imunizovaných myší. Chimerické VLPs odvozené od myšího polyomaviru nesoucí epitopy lidského fúzního proteinu Bcr-Abl (Bcr-Abl VLPs) Na základě modelových EGFP-VLPs jsme připravili chimerické Bcr-Abl VLPs nesoucí 171 aminokyselinovou sekvenci z oblasti zlomu lidského fúzního proteinu Bcr-Abl. Bcr-Abl VLPs jsme použili k imunizaci myší a studovali jsme jejich imunitní odpovědi. Prokázali jsme vysoký titr protilátek proti VP1 v sérech imunizovaných myší, avšak protilátky proti Bcr-Abl jsme nebyli schopni detekovat. Bcr-Abl VLPs aktivovaly...
|
|
|
Využití rekombinantních virů vakcinie produkujících IGFBP3 pro terapii nádorů
Musil, Jan ; Němečková, Šárka (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent)
Využití rekombinantních virů vakcinie produkujících IGFBP-3 pro terapii nádorů Vazebný protein typu 3 pro růstové faktory podobné insulinu (IGFBP-3) je hlavním regulátorem endokrinní aktivity IGF a je schopný potlačovat růst celé řady nádorů. Řada vědeckých prací ukázala, že IGFBP-3 je schopný indukovat apoptózu v nádorových buňkách mechanizmy spojenými s jeho IGF vazebnou funkcí a mechanizmy na této funkci nezávislými. Připravili jsme rekombinantní viry vakcinie exprimující IGFBP-3 pod kontrolou přirozeného časného H5 a syntetického časně-pozdního (E/L) promotoru, abychom ověřili jeho protinádorový efekt na našem modelu karcinomu děložního čípku. Zjistili jsme, že samotná exprese IGFBP-3 růst nádorů nijak neovlivňovala. Exprese IGFBP-3 dvojitými rekombinantami měla ovšem na protinádorovou odpověď pozitivní vliv. Dvojité rekombinanty kromě IGFBP-3 exprimují také fúzní protein SigE7LAMP schopný indukovat imunitní odpověď proti nádorům vyvolaným virem HPV16. Zjistili jsme, že koexprese IGFBP-3 dvojitou rekombinantou P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 posiluje protektivní imunitní odpověď proti nádorům vyvolaným buňkami MK16/ABC dosud nepopsaným mechanizmem. Dále jsme prokázali, že obě připravené dvojité rekombinanty P13- SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 a P13-SigE7LAMP-E/L-IGFBP-3 posilují protinádorovou odpověď vyvolanou expresí...
|
|
|
HIV - 1 Protease: Insights into Drug Resistance Development
Grantz Šašková, Klára ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent) ; Dohnálek, Jan (oponent) ; Schiffer, Celia (oponent)
Aminokyselinové záměny v HIV proteáze či jejím substrátu, které snižují citlivost k proteázovým inhibitorům, představují celkem složitý problém, který není jasně charakterizován. Četné mechanismy, jakými mnohdy velmi komplikovaná skladba mutací ovlivňuje vazbu inhibitoru, musí nutně být analyzovány na molekulární úrovni, a to nejlépe sérií metod, počínaje experimenty s rekombinantními viry, enzymovými esejemi, strukturálními a termodynamickými studiemi či molekulární dynamikou. Každý výsledek pak může pomoci sestavit dohromady jakousi mozaiku evoluce vzniku rezistence k proteázovým inhibitorům, a tím se nepřímo podílet na vývoji ještě účinnějších léků tzv. třetí generace cílených proti HIV/AIDS. Tato dizertační práce představuje několik analýz zabývajících se vznikem rezistence u HIV viru právě na molekulární úrovni. Zaměřili jsme se konkrétně na evoluční dráhu vedoucí k rezistenci k proteázovému inhibitoru nelfinaviru, dále na tzv. lopinavirové mutační skóre, poté na výskyt aminokyselinových inzercí v genu HIV proteázy a jejich vliv na rezistenci k proteázovým inhibitorům a v neposlední řadě jsme analyzovali vysoce mutované varianty HIV proteázy izolované z pacientů, u kterých již nebyla účinná terapie darunavirem. Jelikož jsme byli schopni pracovat s širokou škálou technik, podařilo se nám...
|
|
| |
|
|
Cytoskelet v pohybech myšího polyomaviru od povrchu buňky k buněčnému jádru
Klímová, Lucie ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šmahel, Michal (oponent)
6 Roles of cytoskeleton in mouse polyomavirus trafficking ABSTRACT: Mouse polyomavirus (mPyV) is small non-enveloped DNA virus. Its endocytic pathway is studied for a potential utilisation of polyomaviral virus-like particles in gene therapy and/or immunotherapy. mPyV enter cells by internalisation into smooth monopinocytic vesicles. During it's journey through the cell, it pass through early endosomes, and at the time 3 hours post infection, it is localised in endoplasmic reticulum and recycling endosomes. Many aspects of mPyV trafficking and nuclear entry are not clear yet. Time-lapse live imaging fluorescence confocal microscopy was used to describe the mouse polyomavirus intracellular movements. For these studies, we utilised mPyV fluorophore-labeled virions and cells expressing GFP-tagged g-actin or alpha-tubulin. Some virion-loaded vesicles were seen to move with actin organised into dynamic structures. Some of these structures resembled actin comets created by Listeria or vaccinia virus. At the same time post infection (40-60 min post infection), movement of the virion loaded vesicles along mirotubules was observed suggesting the simultaneous involvement of actin and tubulin during mPyV trafficking. Dynamitin, a dominant negative inhibitor of dynein-dynactin function reduced mPyV infection. Taken...
|
host ::
RSS.