|
|
Influence of freezing and thawing process on cryopreserved cells nuclei and surfaces. Functions and physico-chemical properties of cryoprotectants.
Golan, Martin ; Kratochvílová, Irena (vedoucí práce) ; Raška, Milan (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
1 Abstrakt: Kryoprezervace buněk je komplexní proces nalézající uplatnění v základním biologickém výzkumu, lékařství i zemědělství. Tato práce prohlubuje současné chápání kryoprezervace buněk a jejích důsledků, a to na biologické i fyzikální úrovni. Výsledky obsahují charakteristiku chování vybraných kryoprotektantů (především DMSO, trehalóza, antifreeze protein ApAFP752) v kapalné fázi, v pevné fázi i během tuhnutí. Pozornost je rovněž věnována charakteru a míře poškození rozmrazených buněk, u nichž byla sledována jejich viabilita a vývoj stavu jejich povrchu a jádra (integrita jaderné membrány, úroveň kondenzace chromatinu, přitomnost dvojných zlomů DNA). Důležitým výsledkem je, že S-fázní buňky (NHDF a MCF7 linie) během kryoprezervace utrpí rozsáhlý kolaps replikačních vidliček, což představuje závažné poškození. Je tedy vhodnější mrazit buňky v jiných fázích buněčného cyklu. Ke sledování stavu rozmrazených buněk byla použita především mikroskopie atomárních sil (AFM), konfokální fluorescenční mikroskopie a průtoková cytometrie. Získané poznatky mohou být použity k optimalizaci používaných kryoprezervačních protokolů a k lepšímu hodnocení účinnosti a šetrnosti nově vyvinutých kryoprotektantů.
|
|
|
Structural biochemistry of human NK cell receptor complex NKp30 and B7-H6
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Přirozeně zabíječské buňky (zkráceně NK buňky) jsou lymfocyty nespecifického imunitního systému, které vynikají schopností rychle rozpoznat a eliminovat infikované, či nádorové buňky. Přestože jejich schopnost imunitního dohledu nad maligní transformací byla potvrzena již před lety, aktuální výzkum stále ukazuje, že tento proces je velice komplikovaný. NKp30 je jedním z hlavních aktivačních receptorů NK buněk s potenciálem k využití v cílené imunoterapii. Ektodoména NKp30 v roztoku oligomerizuje, tento jev ovšem závisí na přítomnosti C-koncového "stalk" regionu. Struktura oligomerů NKp30 a jejich role v přenosu signálu je zatím nejasná. Interakce NKp30 s ligandy je navíc ovlivněna přítomností N-vázané glykosylace. V rámci této práce jsme zjišťovali, zda a jak oligomerizace NKp30 závisí na jeho glykosylaci. Naše výsledky ukazují, že NKp30 tvoří oligomery, ať už je na něm glykosylace přirozená, či jednoduchá (získaná expresí v linii HEK293S GnTI- ). Oproti tomu bylo zjištěno, že NKp30 tvoří pouze monomery, je-li enzymaticky deglykosylováno. Dále jsme charakterizovali interakci s ligandem B7-H6, opět s ohledem na oligomerizaci a glykosylaci a vyřešili krystalovou strukturu jeho komplexu s glykosylovaným NKp30, díky které jsme odhalili glykosylací indukovanou dimerizaci NKp30. Tato práce přináší nový...
|
|
| |
|
|
Molecular basis of endothelial sysfunction: endothelial nitric oxide synthase and heme oxygenase 1 genetic variations
Král, Aleš ; Martásek, Pavel (vedoucí práce) ; Baxová, Alice (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Endoteliální dysfunkce je patologický stav charakterizovaný narušenou rovnováhou mezi vazodilatačními a antitrombotickými mediátory a vazokonstriktivními a protrombotickými mediátory produkovanými cévním endotelem. Řada faktorů vede k narušení produkce nebo zvýšené konsumpci oxidu dusnatého (NO), produkovaného syntázami oxidu dusnatého (NOS), který je klíčovým mediátorem cévní homeostázy. Endoteliální dysfunkce představuje jeden z počátečních kroků v rozvoji aterosklerózy, chronického zánětlivého onemocnění cévní stěny. Inducibilní enzym hem oxygenáza 1 (HO-1) představuje jeden z hlavních buněčných obranných mechanismů proti zvýšenému oxidativnímu stresu a snížené dostupnosti NO, které jsou průvodními jevy endoteliální dysfunkce a aterosklerózy. Studovali jsme genetické determinanty endoteliální dysfunkce a aterosklerózy pomocí hodnocení vlivu G894T polymorfizmu endotelové NOS (eNOS) a (GT)n polymorfizmu promotoru HO-1 na rozsah a rizikový profil koronární aterosklerózy a jejich vývoje během hypolipidemické léčby. Dále jsme hledali genetické varianty v exonech 25 a 26 genu eNOS kódujících C-terminální část proteinu, která je považovaná za klíčovou pro správnou funkci enzymu a 3' nepřepisovanou oblast klíčovou pro stabilitu eNOS mRNA. Nenalezli jsme asociaci eNOS G894T polymorfizmu s rozsahem a...
|
|
|
Molecular pathology of selected inherited hyperbilirubinemias
Šlachtová, Lenka ; Martásek, Pavel (vedoucí práce) ; Schneider, Bohdan (oponent) ; Králová, Jarmila (oponent)
SOUHRN Dědičné hyperbilirubinémie představují skupinu metabolických onemocnění, charakterizovaných zvýšenou hladinu celkového bilirubinu nebo jeho konjugované frakce v séru. Většina těchto hyperbilirubinémií je děděná autosomálně recesivně a jsou manifestovány zejména v mladém věku. Zvýšený bilirubin je zapříčiněn poruchami v některém z enzymů metabolické dráhy hemové degradace, ať už jeho konjugace (UGT1A1) nebo transportu (ABCC2, OATP1B1, OATP1B3). Všechny proteinové produkty těchto genů se účastní nejen eliminace bilirubinu, ale take různých dalších substrátů. Studie těchto protein mají tedy široký farmakogenomický vliv. Tato studie popisuje molekulární podstatu dědičných hyperbilirubinémií u kavkazské a romské populace, srovnává klinická a biochemická data s výsledky molekulární genetiky. Dále popisujeme vliv současného výskytu variant c.-3279T>G a g.175492_175493insTA na hladinu celkového sérového bilirubinu . Stanovili jsme vazebnou nerovnováhu obou variant lokalizovaných v promotorové oblasti genu UGT1A1. Zároveň jsme ověřili konzistenci populačních dat s výsledky v literature. Ve druhé studie jsme popsali vzácnou konjugovanou hyperbilirubinémii Dubin-Johnsonova typu u 7 romských rodin. Našli jsme novou variantu v ABCC2 genu NG_011798.1:c.[1013_1014delTG] a take dvojitý genetický defect - kombinaci...
|
|
|
Study of structural features of single stranded DNA by biophysical techniques and crystallography
Svoboda, Jakub ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ve všech doménách života je DNA základní molekolou, její úloha v dědičnosti je dobře etablovaná. Ačkoliv její proslavená dvojšroubovicová komplementární forma je nenahraditelná pro replikační mechanismus, může i tak zaujímat širokou škálu konformačních rodin. V dřívějších pracích studované jednovláknové bakteriálním Repetitivním Extragenním Palindromickým (REP) sekvencím příbuzné DNA oligomery vykazovali komplexní spektrální profil zahrnující dvojšroubovice, vlásenky a tetraplexy. Studie předkládané v této práci rozšiřují měřítko analyzovaných sekvencí a mapují konformační prostor s REP příbuznými oligonukloetidy s použitím cirkulárního dichroismu a krystalografie. Spektrální data a krystalové struktury tří oligonukleotidů jsou reportovány. Všechny tři varianty krystalizovali do duplexové formy se dvěma po sobě jdoucími T-T páry v centrální části. Pro vylepšení rafinačního procesu krystalových struktur byly použity nové dinukleotidové konformační třídy, NtC. Klasifikace pomocí NtC byla použita také k analýze vybraných nekanonických párů v krystalových strukturách získaných z PDB. Následně byl měřen fit mezi geometrií nukleotidů zapojených v nekanonických párech a NtC třídami, tento fit byl dále korelován s elektronovou hustotou analyzovaného dinukleotidu. Tento nový typ měřítka kvality odhalil, že...
|
|
|
Modulace interakcí interleukinů a jejich receptorů
Nepokojová, Tereza ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent)
Skafoldy jsou proteiny s vysokou konformační stabilitou, díky kterým mohou být do určitých úseků proteinu zaváděny vícečetné mutace. I přes tyto mutace zůstává celková strukturální integrita proteinu zachována, stejně tak jeho fyzikálně-chemické vlastnosti. Mutacemi získává daný skafold nové vlastnosti, přičemž ve většině případů se jedná o vazebnou specifitu vůči předem určené molekule. Hlavní výhodou skafoldů je malá velikost, stabilita, nízká výrobní cena a snadnost přípravy. Skafold, se kterým bylo v této práci pracováno, je unikátní tím, že měl navržené dva vazebné povrchy, na kterých mohl být mutován. Každý z obou vazebných povrchů je možné nezávisle mutovat tak, aby na nich vzniklo vazebné místo pro jiný protein. V našem případě šlo o mutace vedoucí k vazbě dvou různých receptorů lidského cytokinu. Mutace se provádí pomocí kvasinkového displeje, jednou z metod řízené evoluce. Předmětem této diplomové práce je přenesení vazebných proteinů z kvasinkového expresního systému do systému bakteriálního, jejich produkce a purifikace a jejich následná charakterizace pomocí vybraných biofyzikálních metod. Pomocí těchto metod byla hodnocena stabilita struktury vazebných proteinů, jejich teplotní stabilita a vazebná afinita vůči oběma receptorům. Širším cílem projektu, jehož je tato práce součástí, je...
|
|
|
Study of DNA hydration by analysis of structural data from databases
Šrůtková, Alžběta ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Hoksza, David (oponent)
Deoxyribonukleové kyseliny hrají zásadní roli v živých organismech tím, že ukládají genetickou informaci. Proces přenosu, translace a transkripce genetické informace je prováděn molekulami, většinou proteiny, které způsobují ohyb a lokální deformaci vázané DNA. Tyto interakce spolu s nukleotidovou sekvencí formují DNA do různých konformací. Popis a klasifikace lokální strukturní diverzity DNA na úrovni dinukleotidů je poskytován tzv. třídami dinukleotidových konformerů, NtC. Klasifikační systém NtC vytvořený pro popis lokálních konformací nukleových kyselin se skládá z 97 tříd NtC. V této práci diskutujeme 44 tříd důležitých pro popis DNA konformací. Všechny biomolekuly, včetně DNA, jsou silně hydratované. První hydratační vrstva kolem DNA je z velké části lokalizována. Struktura této hydratační vrstvy závisí na sekvenci a konformaci analyzované biomolekuly. Strukturální klasifikace DNA do tříd NtC umožňuje specifické studium první hydratační vrstvy s dostatečnou sekvenční a strukturní granularitou. Na základě údajů dostupných ve strukturních databázích jsme studovali hydrataci dvoušroubovicových tetranukleotidových fragmentů ve třech biologicky nejdůležitějších konformačních třídách DNA: BI forma (NtC třída BB00), A forma (NtC třída AA00) a BII forma (NtC třída BB07).
|
|
|
Studie jednovláknových DNA biofyzikálními metodami
Svoboda, Jakub ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
DNA je základní funkční molekula všech domén života. Jednou z jejích charakteristických vlastností je asociace do tvorby dvouvláknové šroubovice. Přesto může i jednovláknová DNA tvořit nekanonické struktury jako například vlásenky, triplexy nebo tetraplexy. Mezi zajímavé jednovláknové sekvence patří REP elementy. Tyto úseky DNA jsou zástupcem bakteriálních transpozonů tzv. inserčních sekvencí, které se vyskytují ve velkém počtu kopií v široké škále bakteriálních organismů. Tato práce se zabývá studiem struktury a charakterizací vybraných REP sekvencí. Jsou předkládány výsledky měření oligonukleotidů se sekvencemi REP elementů spektrální metodou cirkulárního dichroismu, kalorimetrickým měřením a strukturní analýzy jejich monokrystalů difrakcí paprsků X. Klíčová slova Jednovláknová DNA, krystalografie, cirkulární dichroismus, kalorimetrie, transpozony, REP elementy, inserční sekvence.
|
|
|
Targeted modifications of the protein-protein interactions: Ternary complex of interferon-γ as a model system
Zahradník, Jiří ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Klíčovým požadavkem pro detailní porozumění biologických procesů, až na molekulární úroveň, je znalost struktury interagujících molekul a jejich komplexů. Jako modelový systém, pro naši studii, jsme si zvolili IFN-γ. Ačkoliv je tato molekula jedním ze zásadních modulátorů imunitní odpovědi, a je studována již více než 60 let, tak struktura přídavného receptoru (IFN-γR2) a porozumění celému komplexu je nedostačující. V této práci jsme se nejprve zabývali binárním systémem IFN-γ s jeho receptorem, který vykazuje vysokou afinitu k IFN-γ a prostorová struktura obou dvou molekul je známa. Zaměřili jsme se tedy na modulaci afinity mezi IFN-γ a tímto receptorem. Náš přístup spočíval v inovativní metodě založené na modulaci stability protein-proteinových interakcí pomocí mutagenizace aminokyselinových zbytků umístěných uvnitř struktury proteinu. Podařilo se nám zvýšit afinitu testované interakce sedmkrát. Druhá část projektu byla zaměřena na krystalizaci, vyřešení a popis struktury druhého - přídavného receptoru pro IFN-γ. Naše analýza variabilních aminokyselinových zbytků na povrchu tohoto proteinu a strukturně příbuzných receptorů z rodiny typu II odhalila možné vazebné místo pro IFN-γ. Ve třetí části naší práce jsme se zaměřili na krystalizaci IFN-γ z platýze druhu Paralichthys olivaceus a tuto...
|
host ::
RSS.