|
|
Fyziologické a patologické faktory ovlivňující absorpci léčiv
Ryšánek, Pavel ; Šíma, Martin (vedoucí práce) ; Mičuda, Stanislav (oponent) ; Dražanová, Eva (oponent)
Absorpce léčiv z gastrointestinálního traktu po perorálním podání je klíčovým farmakokinetickým procesem spoluurčujícím následnou farmakodynamickou odpověď organismu a terapeutickou účinnost. Tato dizertační práce je věnována studiu faktorů, které tento proces ovlivňují. Zvláštní důraz je kladen na studium lymfatické absorpce, tj. míry vstřebávání účinné látky cestou intestinálního lymfatického systému. Byla provedena řada in vivo studií na laboratorních potkanech. Farmakokinetické studie byly prováděny pomocí pravidelných odběrů krve z cévních katetrů po perorálním podání léčiva. Lymfatická absorpce byla zkoumána na modelu anestezovaného potkana se zakanylovaným mezenterickým lymfatickým duktem. Testovány byly moderní léky, které byly spolupracujícími chemicko-technologickými pracovišti upraveny do inovativních lékových forem. Abirateron acetát, lipofilní látka používaná v terapii karcinomu prostaty, se dobře vstřebával z trávicího traktu po podání ve formě olejových kuliček (oil marbles). Touto technologií se též podařilo snížit jinak velmi výrazný pozitivní vliv jídla. Abirateron acetát se nevstřebával ve významné míře cestou intestinálního lymfatického systému. Lymfatická absorpce cinakalcetu, látky používané k léčbě hyperparatyreózy, byla naopak výrazná. Relativní podíl lymfatické absorpce na...
|
|
|
Biotechnologické využití rostlinných virů
Vaculík, Petr ; Čeřovská, Noemi (vedoucí práce) ; Ryšánek, Pavel (oponent) ; Petrzik, Karel (oponent)
Model terciární struktury kapsidového proteinu X viru bramboru (PVX CP) byl využit jako předloha pro navržení nových pozic pro vkládání antigenů za účelem jejich prezentace na povrchu částic PVX. Na základě tohoto modelu bylo vybráno sedm pozic (A-G), které se nacházejí na povrchu virionu. Jako antigen pro prezentaci byl použit 17 aminokyselinový epitop onkoproteinu E7 odvozený od lidského papilomaviru typu 16 (E7 epitop) ve fúzi s 6xHis kotvou nebo StrepII kotvou, a to v obou možných uspořádáních (6xHis-E7, E7-6xHis, StrepII-E7 a E7-StrepII). Modifikované PVX CP byly nejprve exprimovány v Escherichia coli MC1061, kde docházelo k tvorbě virových částic pouze v případě vložení inzertů StrepII-E7 a E7-StrepII do pozice A v PVX CP. Výsledky z transientní exprese modifikovaných PVX CP v Nicotiana benthamiana prokázaly, že nejvhodnější pozice pro prezentaci antigenů je pozice A, která je situovaná mezi 24. a 25. aminokyselinou v PVX CP. Dále bylo zjištěno, že virové částice mohly být detekovány pouze v přítomnosti StrepII kotvy a že stabilita těchto částic je ovlivněna uspořádáním inzertu (StrepII-E7 vs. E7-StrepII), neboť bylo možné purifikovat pouze virové částice nesoucí inzert v uspořádání E7-StrepII. Kromě využití PVX pro přípravu antigen prezentujícího systému byl také posouzen vliv infekce PVX na...
|
|
|
Produkce heterologních proteinů v rostlinách se zaměřením na antigeny odvozené od lidského papillomaviru (HPV 16)
Folwarczna, Jitka ; Čeřovská, Noemi (vedoucí práce) ; Ryšánek, Pavel (oponent) ; Kumar, Jiban (oponent)
6 Abstrakt Infekce lidskými papillomaviry (HPV) je zejména v rozvojových zemích stále velkým problémem. Přestože jsou proti HPV komerčně dostupné profylaktické vakcíny, je jejich využití ekonomicky náročné a neřeší problém již infikovaných osob. Proto se vyvíjí další úsilí vedoucí ke vzniku terapeutických vakcín a zároveň se hledají postupy vedoucí ke snížení produkční ceny profylaktických vakcín. Virové proteiny, jako například E7 onkoprotein a L2 kapsidový protein z HPV typu 16, patří mezi slibné kandidáty pro přípravu experimentálních vakcín proti HPV. V předkládané práci jsme optimalizovali expresi mutovaného E7 onkoproteinu (E7ggg) připojeného k C-konci kapsidového proteinu (CP) Viru tabákové mozaiky (TMV) nebo X viru bramboru (PVX). Byl sledován vliv linkerů spojujících CP a E7ggg na expresi a stabilitu fúzních proteinů. Fúzní proteiny byly nejprve produkovány v bakteriích Escherichia coli (E. coli) MC1061 a poté v netransgenních i transgenních rostlinách Nicotiana benthamiana (N. benthamiana). Protože se fúzní proteiny obsahující TMV CP připravené v E. coli produkovaly v nerozpustné podobě, byl pro zvýšení podílu rozpustných proteinů testován vliv molekulárních chaperonů (Trigger faktoru (TF), DnaK-DnaJ-GrpE, GroEL- GroES). L2108-120 epitop připojený k C-konci PVX CP byl produkován v...
|
|
|
Vliv nematofágních hub na populace významných fytoparazitických háďátek čeledi Heteroderidae na území ČR
Hussain, Manzoor ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Vadlejch, Jaroslav (oponent)
Máme zprávy o studiích, jejichž cílem je vyhodnotit dopady pěti nematophagous hub na populační dynamiku severní kořenového uzlu hlístice, Meloidogyne Hapla a cukrové řepy cyst háďátka, háďátko řepné v laboratorních a skleníkových pokusech. Během našich biokontrolních studií, a to především pět druhů hub Arthrobotrys oligospora, Dactylella oviparasitica, Clonostachys rosea, Stropharia rugosoannulata a Lecanicillium muscarium byly izolovány z eggmasses hlístů při kořenových a půdních vzorků odebraných v České republice a testovány proti Meloidogyne Hapla v mrkvi, zatímco háďátko řepné v cukrové řepy, a to jak in-vitro a in-vivo způsoby. Všechny houby vystavoval pestrý druh infekce u hlístic, ale L. muscarium Ukázalo se, že největší potenciál bioagent v hlísty populace enormně. Lecanicillium muscarium zastavil nejen rozmnožování faktor hlístic (Pf / Pi), ale také se vyhrotila růst rostlin. kořenové systémy rostlin ošetřených L. muscarium byly pozorovány kolonizovány houbami, zatímco vidět pod mikroskopem který popsal, že houby za předpokladu, chránící štít nebo tělesná stráž proti rostlin parazitických hlístic. Kromě toho, L. muscarium byl dále ve srovnání s komerčně dostupnými nematocidy a hnojivo pro zdůvodnění jejího vysoce potenciál pro snížení háďátka populaci. L. muscarium spolu s nematocidy a hnojiv měla dramatické účinky na snížení obou hlístic (M. Hapla, H. schachtii) populace v půdě, ale zlepšení růstu rostlin byla zjištěna pouze v případě L. muscarium. Chemická nematicid, dazomet měl některé negativní účinky, které se objevily ve formě chlorotické skvrny na listech, které dále vyplývá, že existují některé jsou fytotoxické účinky.
|
|
|
Identification and molecular characterization of the putative immunophilins (IMMs) in the oilseed rape pathogens Leptosphaeria maculans, Leptosphaeria biglobosa, and Plasmodiophora brassicae
Sandhu, Khushwant Singh ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Radovan, Radovan (oponent)
Oilseed rape is largely infected by several phytopathogens and two most economical important diseases are blackleg caused by fungus species complex Leptosphaeria maculans and L. biglobosa and clubroot caused by protist P. brassicae. The sequenced genomes of these phytopathogens provide opportunity to uncover various aspects related to disease infection, host pathogen interactions, plant disease resistance, and evolution of pathogens. Considering these we focused on one of the most conserved family called immunophilins (IMMs) in these genomes. IMMs are comprised of three structurally unrelated sub-families including cyclophilins (CYPs), FK506-binding proteins (FKBPs), and parvulin-like proteins (PARs). We identified putative members of IMMs in each phytopathogen using bioinformatics approaches. We further characterized the IMMs based on domain architecture, subcellular localization, exon-intron organization, transcriptomic expression patterns, gene ontology terms, conserved motifs presents and evolutionary analyses. IMMs are performing several vital roles in plants, animals and fungi. However, in phytopathogens their roles are not well established except for cyclophilin that implicates in pathogenicity in some phytopathogens. Therefore, we exploited the role of cyclophilin in L. maculans and L. biglobosa using expression profiles and in P. brassicae using Magnaporthe oryzae cyclophilin deletion mutant. Overall, we concluded that the cyclophilin acts as a virulence determinant in our studied phytopathogens. However, delineating the precise role of other IMMs would also be imperative. Taken together, our findings for the first time shed light on the highly conserved IMM family in the oilseed rape pathogens.
|
|
|
Diagnostika významných virů jabloní
Winkowska, Lucie ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Petr, Petr (oponent)
Virus mozaiky jabloně (Apple mosaic virus, ApMV), virus žlábkovitosti kmene jabloně (Apple stem grooving virus, ASGV), virus vrásčitosti kmene (Apple stem pitting virus, ASPV) a virus chlorotické skvrnitosti listů jabloně (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) jsou ekonomicky významné viry jádrovin, které jsou celosvětově rozšířeny a mohou způsobit značné snížení výnosu. Hlavní kontrolní strategie (konkrétně detekce patogena, certifikace, karanténa atd.) jsou závislé na přesných a citlivých detekčních metodách a na perfektní znalosti patogena.
V rámci disertační práce byla optimalizována detekční metoda kvantitativního RT-PCR (qRT-PCR) pro detekci a kvantifikaci čtyř studovaných virů. Získané výsledky naznačily, že qRT-PCR je nejspolehlivější technika ve srovnání s konvenčními metodami DAS/I-ELISA a RT-PCR.
V naší studii při kvantifikaci virů pomocí qRT-PCR se ukázalo, že koncentrace ASGV, ASPV a ACLSV je stabilní v průběhu vegetace a v různých rostlinných tkáních. Výjimku představuje ApMV, u kterého se během vegetace měnil obsah v listech a lýku. Tyto výsledky naznačují, že změny v koncentraci virů pozorované metodami DAS/I-ELISA a RT-PCR v rostlinných tkáních jsou důsledkem jiných vlivů (inhibitory, stárnutí rostlinných tkání, nižší citlivost atd.) než změnami v samotné koncentraci virů v rostlinách.
V průběhu monitoringu (celkem bylo otestováno 351 stromů) se ukázalo, že studované viry jsou více rozšířeny v jabloňových sadech a v zahradách než v planých volně rostoucích jabloních.
Vybrané virové izoláty planých a kulturních jabloní byly osekvenovány a byla studována jejich molekulární variabilita i v porovnání s již publikovanými izoláty studovaných virů. Nebyly však objeveny žádné výrazné rozdíly mezi jednotlivými izoláty a ani nalezen žádný vztah s jejich geografickým původem nebo typem výsadby, ze které pocházely.
|
|
|
Plasmodiophora brassicae na ozimé řepce
Řičařová, Veronika ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Jaroslav, Jaroslav (oponent)
Ozimá řepka (Brassice napus) je v České republice důležitou plodinou. Nádorovitost kořenů brukvovitých, jejíž původcem je Plasmodiophora brassicae Wor., je závažným a rostoucí problém při pěstování řepky. Výzkum P. brassicae v ČR je tedy důležitý pro vývoj efektivních strategií managementu nádorovitosti v českých podmínkách.
Jeden z hlavních cílů studie byl monitoring patogena. Choroba se dříve šířila především díky zelinářské produkci a zahrádkářům. Od roku 2010 se začala choroba objevovat i na řepce, především v severovýchodní části republiky. Přítomnost nádorovitosti byla sledována po dobu pěti let na základě symptomů agronomickou službou Svazu pěstitelů a zpracovatelů olejnin. Výskyt patogena a symptomy nádorovitosti byly nahlášeny ze všech krajů ČR kromě Ústeckého, celkem ve 31 ze 76 okresů. V současnosti (podzim 2015) je známo 130 lokalit, toto číslo bude ovšem jistě stoupat. Některé vzorky půdy byly testovány pomocí konvenční PCR (polymerázová řetězová reakce), aby se posoudila možnost použití této metody pro diagnostiku patogena. Všech 14 podezřelých vzorků bylo pozitivních.
Dalším cílem studie bylo zjistit patotypové složení izolátů P. brassicae z České republiky pomocí tří klasifikačních systémů, a také jejich analýza pomocí klasické PCR a kvantitativní PCR. Byly zjištěny značné rozdíly mezi populacemi P. brassicae, a počet patotypům se měnil v závislosti na systému hodnocení a prahu použitém pro rozlišení citlivé vs. rezistentních reakce rostlin. Při užití prahové hodnoty 25 % ID k odlišení citlivé vs. rezistentní reakce, bylo určeno celkem pět patotypům na základě Williamsova systému, pět patotypů pomocí systému Somé et al. a 10 patotypů pomocí s ECD systému. Na základě prahové hodnoty 50 % ID, bylo zjištěno pět patotypů podle systému Williames, čtyři na základě systému Somé et al. a 8 pomocí souboru ECD. Změna prahových hodnot vedla k přeřazení některých patotypům. Patotyp 7 podle Williamse byl nejčastější u obou prahových hodnot. Vysoké množství DNA patogena bylo nalezeno ve většině vzorcích půd analyzovaných pomocí kvantitativní PCR (qPCR).
Experimenty s odrůdami řepky rezistentními k P. brassicae byly provedeny na zamořeném pozemku a ve skleníku. Ve skleníku bylo pěstováno šest rezistentní odrůd v zamořené půdě odebrané z různých lokalit v České republice a byly hodnoceny indexem napadení (ID %). Nejlepší výsledky (nejnižší ID) přinesla odrůda Mentor (2 +- 0,7 %), těsně následovala odrůda SY Alister (5 +- 1,1 %), nejvyšší index napadení měla odrůda CHW 241 (30 +- 3,8%). V první sezóně polního pokusu bylo testováno sedm rezistentních odrůd, vývoj napadení byl sledován každý měsíc. Nejnižší index napadení měla odrůda Andromeda (3 +- 0,8%) a PT 235 (4 +- 1,5%), naopak nejvyšší ID měla opět odrůda CWH 241 (46 +- 6,5%). Ve druhé sezóně žádná z odrůd nedosáhla 25 % ID (odrůda CWH 241 byla z pokusů stažena na základě žádosti dodavatele osiva). Nejvyšší výnos byl dosažen odrůdou SY Alister (6,1 t / ha) v první sezóně a odrůdou PT 242 (5,03 t / ha) ve druhé sezóně pokusů. Koncentrace inokula na poli byla měřena pomocí metody qPCR a byla vytvořena mapa zamoření pole. Nejvyšší koncentrace spor byly nalezena na vjezdu na pole. Všechny získané informace o účinnosti rezistence a diverzitě populací P. brassicae z České republiky lze využít ke zefektivnění ochrany proti nádorovitost na našem území.
|
|
|
Bionomie a fyziologie skladištního roztoče Tyrophagus putrescentiae (Acari: Acaridida)
Rybanská, Dagmar ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Vladimír, Vladimír (oponent)
Potraviny kontaminované roztoči jsou nepřijatelné z ekonomického hlediska i zdravotního rizika. Tyrophagus putrescentiae (Shrank, 1781) je kosmopolitní roztoč, který preferuje potraviny s vysokým obsahem tuku a proteinů. Je převládajícím druhem roztoče napadající krmiva pro psy, která se tak stávají novým zdrojem alergenů v domácnostech. Výsledky této studie potvrdily, že potrava s vysokým obsahem tuků a proteinů zvýší populační růst roztočů, ve srovnání s potravou s vysokým obsahem sacharidů. Tato studie umožní lépe predikovat výskyt a růst roztočů v různém prostředí a vyhodnotit strategie týkající se prevence kontaminace.
Exkrementy roztočů představují nebezpečnou směs alergenů pro člověka i zvířata a výsledky práce zvyšují význam alergenů detekovaných v exkrementech. Zjištěná symbiotická interakce roztoče s B. cereus má velký medicinální význam.
|
|
|
Použití rostlinných virů pro navození cílených epigenetických změn u Solanum tuberosum a Nicotiana benthamiana
Dušek, Jakub ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Barbora, Barbora (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá navozením cílených epigenetických změn pomocí upraveného X viru bramboru (PVX, Potato virus X). Z rostlin Solanum tuberosum a Nicotiana benthamiana byl pomocí PCR a speciálně navržených primerů izolován gen nesoucí sekvenci PDS. Primery byly navrženy tak, aby byly univerzální pro obě rostliny a Tm teplota byla v rozmezí 5 °C. Na hraničních úsecích PCR produktů byla přidána restrikční místa (XhoI a ClaI) navržena tak, aby po vložení do PVX byla sekvence PDS v AS orientaci. Virový vektor pGR106 byl později vnesen do rostlin za pomoci Agrobacterium tumefaciens. Tím došlo k degradaci cílového transkriptu, vedoucího k umlčení (silence) genu. Jedná se tedy PTGS (posttranscriptional gene silencing). Fenotypovým projevem je částečné vyblednutí zeleného rostlinného pletiva.
Část rostlin se inokulovala v podmínkách in vitro, a proto musela být vypracována nová metodika, umožňující účinnou inokulaci rostlin sterilním virovým inokulem.
|
|
|
Mutační analýza obalového proteinu X viru bramboru (PVX)
Werschallová, Markéta ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Jan, Jan (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá mutační analýzou konzervovaných aminokyselin obalového proteinu (CP, coat protein) X viru bramboru (PVX, Potato virus X), kterou má být zjištěna důležitost vybraných aminokyselin pro šíření viru v rostlině. Jako pokusné rostliny byly vybrány tabáky Nicotiana benthamiana. Modifikace v obalovém proteinu byly provedeny na základě porovnání aminokyselinové sekvence obalového proteinu PVX s CP viru mozaiky papáji (PapMV CP, Papaya mosaic virus coat protein), zatím jediného zástupce potexvirů, kam patří i PVX, s popsanou krystalovou strukturou obalového proteinu, u kterého byla experimentálně potvrzena důležitost určitých aminokyselin pro interakci podjednotek obalového proteinu CP,CP PapMV a CP,RNA a tím i pro tvorbu virových částic. Z databáze National Center for Biotechnology Information (NCBI) byly získány dostupné aminokyselinové sekvence izolátů a kmenů PVX CP, které byly porovnány mezi sebou, ale i se sekvencí PVX využívanou v Laboratoři virologie ÚEB, AV ČR v. v. i. Jako konzervované pozice byly určeny kodóny kódující fenylalanin a lysin v pozici 33 a 118 obalového proteinu, které byly mutovány pomocí metod molekulární biologie.
Celkem bylo vytvořeno 5 konstruktů mutantů obalového proteinu, 2 deleční mutanti N- konce PVX CP, kteří byli vytvořeni ve vektoru odvozeném od PVX (pGR106), ve kterém je integrována cDNA sekvence PVX, zbylí 3 bodoví mutanti byli vytvořeni pouze jako produkt SOE PCR. Do delečních mutantů, u nichž byla odstraněna větší část N- koncové sekvence CP, přesněji sekvence mezi 2.,32. a 2.,33. kodónem, byl zaklonován vytvořený reportérový gen GFP pro sledování nástupu signálu infekce a šíření mutantů v rostlinných pletivech. Ve výsledku se oba mutanti šířili pouze z místa agroinfiltrace do okolních buněk inokulovaného listu. Rozdíl byl zaznamenán jak v rychlosti nástupu signálu GFP, tak i v míře rozšíření mutantů do okolních buněk. Deleční mutant s ponechaným kodónem pro F33 vykazoval jednak rychlejší nástup signálu, ale byl schopen se šířit mnohem rychleji a výrazněji do okolních buněk, ale pouze v rámci inokulovaného listu, zatímco u delečního mutanta s odstraněným kodónem pro F33 byl zaznamenán pomalejší nástup signálu a menší schopnost infikovat okolní buňky. Dále byli vytvořeni bodoví mutanti, deleční a substituční, konkrétně deleční mutant kodónu F33 (delece F33), substituční mutant, u kterého byl kodón fenylalaninu v pozici 33 nahrazen kodónem alaninu (F33A) a substituční mutant, u kterého byl kodón lysinu v pozici 118 nahrazen kodónem alaninu (K118A). Bohužel se nepodařilo bodové mutanty úspěšně vložit do vektoru pGR106, tudíž nebylo možné je zhodnotit v rostlinách N. benthamiana.
Z uvedených výsledků lze usuzovat na důležitost aminokyseliny F33 při mezibuněčném pohybu v rámci sousedních buněk. Pro posouzení důležitosti F33 a K118 v systémové infekci by bylo nutné zhodnotit i bodové mutanty delece F33, F33A a K118A.
|
host ::
RSS.