|
|
Transdiferenciace somatických buněk do hepatocytů a klinicky relevatní editace genu Tight junction protein 2
Fryntová, Lucie ; Janečková, Lucie (vedoucí práce) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Transdiferenciace v buňce indukuje strukturní přestavby chromatinu a epigenetické změny, které ovlivňují spektrum genové exprese a způsobují celkovou remodelaci buňky. Během transdiferenciace dochází k přímé konverzi určité zralé linie somatických buněk na zralou buněčnou linii jiného typu, napříč jednotlivými zárodečnými vrstvami. Diplomová práce byla zaměřena na transdiferenciaci mezenchymálních buněk - myších embryonálních fibroblastů na endodermální buňky - hepatocyty in vitro s použitím kombinace transkripčních faktorů Hnf4α a Foxa1. Mapování přeměny fibroblastů bylo zahájeno bezprostředně po vyvolání konverze a definitivní vznik tkáňové kultury indukovaných hepatocytů byl potvrzen morfologickými a funkčními testy. Myší indukované hepatocyty nasledně sloužily pro modelaci lidského jaterního onemocnění, ilustrujícího anamnézu pacienta z Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze, u kterého nebyla možná imunohistochemická detekce proteinu z jater. Pro genetickou editaci indukovaných hepatocytů byla použita technologie CRIPSR/Cas9, při které byl nukleázou Cas9 a navigující gRNA (guide RNA) vytvořen dvouvláknový zlom v genu Tight junction proteinu 2, a následnou syntézou komplementárního řetězce podle DNA templátu byla vyvolána bodová mutace, měnící triplet aminokyseliny v cílovém...
|
|
|
Modifikace myších nádorových linií systémem CRISPR/Cas9 a charakterizace jejich vlastností
Lhotáková, Karolína ; Poláková, Ingrid (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent)
Molekuly MHCI jsou konstitutivně exprimované na všech jaderných buňkách organismu a hrají klíčovou roli v prezentaci antigenů CD8+ T lymfocytům. Nádorové buňky využívají jako jeden z nejčastějších mechanismů vyhnutí se imunitní odpovědi právě snížení exprese MHCI. To má za následek znemožnění cytotoxickým CD8+ T lymfocytům rozeznat nádorové buňky a vést proti nim imunitní odpověď. Jelikož ke snížení exprese MHCI dochází až u 90 % některých typů nádorů, je třeba mít k dispozici klinicky relevantní model nádorů s ireverzibilně sníženou expresí MHCI, na kterém by bylo možno testovat různé imunoterapeutické přístupy. Tato práce popisuje přípravu nové modelové linie nádorových buněk TC-1 s ireverzibilně sníženou expresí MHCI. Toho bylo dosaženo inaktivací B2m, jež je součástí MHCI molekuly, pomocí systému CRISPR/Cas9. Inaktivace B2m u modifikovaných buněčných linií byla ověřena průtokovou cytometrií, western blotem a sekvenací jednotlivých alel. Po této inaktivaci došlo ke zpomalení růstu nádorových buněk jak in vitro, tak in vivo. Metastatická aktivita buněk nebyla ovlivněna. Nádory vytvořené buňkami s inaktivovaným B2m nejsou citlivé k DNA imunizaci cílené proti onkoproteinu E7 z HPV16 provedené vakcínou pBSC/PADRE.E7GGG. Hlavními efektorovými buňkami v imunitě proti těmto nádorům jsou NK1.1+ buňky....
|
|
|
Role fúzního proteinu ETV6-RUNX1 v citlivosti leukemických buněk na L-asparaginázu
Staněk, Petr ; Starková, Júlia (vedoucí práce) ; Burjanivová, Tatiana (oponent)
Translokace t(12;21) s přítomností fúzního genu ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) je nejčastější chromozomová aberace nacházená u akutní lymfoidní leukemie v dětském věku. Výskyt ETV6- RUNX1 se pojí s výborným výhledem a vysokou citlivostí na léčbu enzymem L-asparaginázou (ASNázou), která deaminuje aminokyseliny glutamin a asparagin. Rezistence na toto léčivo zhoršuje prognózu a zvyšuje riziko selhání léčby, proto se pracovní skupina CLIP věnuje určení mechanismu účinku ASNázy a příčin vzniku rezistence. Tato práce na dřívější poznatky skupiny navazuje a věnuje se analýze významu fúzního proteinu a signalizačním a metabolickým změnám doprovázející posuny v citlivosti leukemických buněk na L-asparaginázu. V první části práce se vytvořením posunu čtecího rámce ve fúzním genu pomocí systému CRISPR/Cas9 podařilo vytvořit knockoutní buněčné klony se stabilně zvýšenou rezistencí vůči ASNáze. Úspěšnou mutageneze a odstranění fúzního proteinu byla ověřena na úrovni DNA, mRNA a proteinu a analýzou SNP byla vyloučena přítomnost jiných závažných aberací ovlivňujících citlivost k chemoterapeutiku. Ve druhé části práce jsem se zabýval pozorování signalizační reakce vyvolané přítomností ASNázy, zejména v souvislosti se signalizačním komplexem mTORC1, a dále odlišných aspektů této reakce mezi původními liniemi REH a klony...
|
|
|
Využití systému CRISPR-CAS9 pro genové manipulace u parazitických prvoků
Ročeň, Milan ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Rada, Petr (oponent)
Systém CRISPR/Cas slouží jako buněčný obranný mechanismus, který chrání bakterie a archea před cizorodou DNA, především bakteriofágy. Jeho produkt utváří ribonukleoproteinový komplex, jehož složkami jsou sgRNA a Cas endonukleasy. Pomocí sgRNA, které jsou komplementární k cizorodé DNA, tuto DNA rozezná a Cas endonukleasy v ní indukují dvojvláknové zlomy. Tato metoda nalézá uplatnění jak v základním výzkumu, kde je aplikovatelná pro funkční analýzu proteinů a studium genové exprese, tak i v aplikovaném výzkumu, kde může uplatnit například v tvorbě geneticky modifikovaných organismů či geneticky atenuovaných vakcín. Tato práce shrnuje dosavadní poznatky o systému CRISPR/Cas a jeho aplikaci pro genovou manipulaci parazitických prvoků.
|
|
|
CRISPR/Cas9-based genome editing in mice: state of the art and future perspectives
Eliáš, Jan ; Kašpárek, Petr (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Mutantní myši jsou klíčové pro odhalení funkce genů in vivo. V posledních letech prošla jejich příprava revolucí díky rychlému rozvoji programovatelných nukleáz, především systému CRISPR/Cas9. Editace genomu založená na vnesení komponentů systému CRISPR/Cas9 do časných vývojových stádií myších embryí umožnila rychlou a levnou přípravu genově deficientních myších modelů, hlavně ve srovnání s tradičními metodami, založenými na modifikacích embryonálních kmenových buněk (ESCs). Schopnost systému CRISPR/Cas9 indukovat na daném místě v genomické DNA dvojvláknový zlom (DSB) umožňuje efektivní narušení správného fungování daného genu díky náhodným mutacím dané sekvence, nebo kompletním vyštěpením daného genu. Přesné modifikace, jako inkorporace fragmentu DNA do daného lokusu, nicméně pořád zůstávají obtížně proveditelné. V této práci shrnuji systém CRISPR/Cas9, jeho použití v produkci mutantních myší a jeho možné modifikace, které by vedly ke zvýšení účinnosti přesných modifikací. Klíčová slova: CRISPR/Cas9, myš, transgeneze, homologní rekombinace
|
|
|
Preparation of nanoparticles for hepatitis B viral therapy
Kružíková, Zuzana ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Žáčková Suchanová, Jiřina (oponent)
Virus hepatitidy B (HBV) je v současné době cílem zájmů na poli základního i farmaceutického výzkumu. Účinná vakcína proti HBV byla vyvinuta již v roce 1982, přesto je však světová prevalence tohoto onemocnění stále vysoká. Chronická infekce HBV může vést k významnému poškození jater a postupně až ke vzniku hepatocelulárního karcinomu. Pro chronickou infekci ovšem stále neexistuje vhodná léčba, jelikož virový genom zůstává v jádře infikovaného hepatocytu ukryt imunitnímu systému ale i antivirovým léčivům. Jedna z nových strategií pro léčbu HBV předpokládá, že virová cccDNA by mohla být zničena pomocí nástrojů genové editace jako je CRISPR/Cas9 systém. Aby mohl být tento systém pro genovou editaci uveden do klinické praxe, CRISPR/Cas9 musí být specificky dopraven do cílových buněk, aby se minimalizovalo riziko štěpení DNA mimo cílené sekvence. Tato diplomové práce se zabývá zaprvé návrhem nových sgRNA mířených proti cccDNA viru hepatitidy B a testování jejich účinnosti a zadruhé tato práce popisuje modulární lipidové nanočástice vyvinuté speciálně pro dopravu CRISPR/Cas9 ve formě RNA. Klíčová slova: virus hepatitidy B, CRISPR/Cas9, editace genů, lipidové nanočástice, dopravování mRNA, cílené dopravování
|
|
|
Metody RNAi a CRISPR a jejich využití pro genetické manipulace parazitických protist
Kaiserová, Veronika ; Votýpka, Jan (vedoucí práce) ; Stojanovová, Darja (oponent)
RNA interference slouží jako obranný mechanismus, pomocí něhož se organismy brání proti cizorodým nukleovým kyselinám. RNAi negativně ovlivňuje translaci vazbou malých nekódujících molekul RNA ke komplementárnímu úseku mRNA, která je následně degradována. Novinkou v oblasti genového inženýrství je metoda CRISPR, která spočívá v modulaci genové exprese tvorbou dvouvláknových zlomů v cílové sekvenci DNA pomocí ribonukleoproteinového komplexu složeného z prokaryotické endonukleázy Cas9 a sgRNA. Obě zmíněné metody jsou použitelné pro funkční analýzu proteinů a charakterizaci metabolických drah u studovaných organismů. Tato práce shrnuje dosavadní poznatky o metodách RNAi a CRISPR a o jejich využití k editaci genomů parazitických protist.
|
|
|
Využití genomové editace k tvorbě velkých zvířecích modelů
Dvořáková, Nikola ; Ellederová, Zdeňka (vedoucí práce) ; Kašpárek, Petr (oponent)
Principem genového inženýrství je zásah do DNA studovaného organismu. Po objevu programovaných endonukleáz došlo k velké expanzi této techniky a otevřely se možnosti pro tvorbu velkých zvířecích modelů, které bylo donedávna velice obtížné vytvořit. Mezi tyto endonukleázy patří zinc finger nuclease (ZFN), transcription aktivátor like effector nuclease (TALEN) a CRISPR/Cas9, ve kterém se dnes skrývá velký potenciál pro tvorbu velkých zvířecích modelů. Všechny endonukleázy vytváří místně specifický sestřih v požadovaném úseku genomu. Tento sestřih se nejsnadněji opraví pomocí připojení nehomologních konců (NHEJ), a tak lze vytvořit tzv. knock-out (KO) model. Druhým typem opravy je homologní rekombinace (HR) využívající DNA templát s homologními rameny. Pomocí toho lze vytvořit knock-in (KI) model, který bez specifických endonukleáz nebylo možné u velkých zvířecích modelů vytvořit díky nízké přirozené HR. Tato práce shrnuje historii, techniku a využití programovaných endonukleáz pro tvorbu velkých zvířecích modelů. Tyto modely mají velké využití v biomedicíně, jsou nezbytnou součástí preklinického výzkumu, ale jsou také významné v zemědělství, a dokonce i v ochraně prostředí. Klíčová slova: velký zvířecí model, transgeneze, genomová editace, CRISPR/Cas9, TALEN, ZNF
|
|
|
Visual system development in Platynereis dumerilii: insight from genetic engineering approach
Dobiášovská, Ivana ; Kozmik, Zbyněk (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Genové regulační sítě zodpovědné za molekulární regulaci vývoje oka jsou evolučně konzervované napříč mnoha organismy. Zástupci genové rodiny transkripčních faktorů Pax patří mezi nejvíce konzervované zástupce těchto sítí. Pax transkripční faktory hrají klíčovou roli při vývoji zásadních součástí oka, přičemž jednou z jejich funkcí je i regulace opsinů - molekul zodpovědných za přeměnu světelného podmětu na elektrochemickou signalizaci ve fotoreceptorových buňkách. V rámci této diplomové práce jsou zkoumány geny pax6 a pax2/5/8 jako potenciální transkripční faktory regulující vývoj oka u modelového organismu Platynereis dumerilii. Na základě sledovaného brzkého počátku exprese pax6 a pax2/5/8 byla testována možná role těchto transkripčních faktorů v regulaci r-opsinu. Expresní analýza pax6 a pax2/5/8 u divokého typu Platynereis je prováděna pomocí "whole mount" RNA in-situ hybridizace, společně s počáteční analýzou Platynereis pax6 knockout linie. Ačkoliv má homozygotní mutace v pax6 letální následky, heterozygotní mutanti přežívají a jsou schopní reprodukce. Uváděná data naznačují, že pax6 nereguluje u Platynereis geny pax2/5/8, otx a six3. Stejně tak r-ops1, tvořící r-opsin přítomný v dospělých očích Platynereis, není regulován pomocí pax6. Pro výzkum potenciální role pax2/5/8 transkripčního...
|
|
| |
host ::
RSS.