|
|
Detekce a filtrace chimér v amplikonové sekvenaci
Heřmánková, Kristýna ; Jurečková, Kateřina (oponent) ; Sedlář, Karel (vedoucí práce)
Chimérické sekvence jsou častým artefaktem vyskytujícím se v sekvenačních datech po amplifikaci vzorků polymerázovou řetězovou reakcí. Výskyt těchto artefaktů může výrazně znehodnotit výsledky prováděné analýzy. Proto je detekce a následná filtrace chimérických sekvencí nezbytným krokem ve výpočetním zpracování sekvenačních dat. Součástí této práce je vysvětlení mechanismu vzniku těchto artefaktů a také možnosti omezení jejich výskytu. Cílem této práce je realizace algoritmu pro detekci a filtraci chimér v jazyce R a následné testování úspěšnosti algoritmu na vlastních datech poskytnutých Výzkumným ústavem veterinárního lekařství v Brně.
|
|
|
Use of DGGE to analysis and identification of selected microorganisms
Jankeje, Kristína ; Čarnecká, Martina (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Presented diploma thesis is focused on use of DGGE to analysis and identification of selected microorganisms. PCR-DGGE is a method that allows direct characterization of the microbial community in the natural environment without necessity of cultivation. A literature review is devoted to the principle of the method, current applications and its limitations too. In experimental part microbial DNA was isolated and used as a template for PCR reaction. Microbial DNA was then amplified using the universal eukaryotic primers that target the D1/D2 domain of the 26S subunit of ribosomal DNA. To improve specificity and sensitivity of detection nested PCR was chosen using outer and inner primer pairs. Generated amplicons (250 bp) were consequently separated by DGGE. The analysis of selected microorganisms by DGGE technique was performed after optimization of electrophoresis conditions (in particular the denaturing gradient extent and separation time). Despite the optimization, mutual differentiation among individual yeast strains was not possible since each reference strain was represented by several bands in the same positions. In conclusion DGGE profile obtained from wine musts is discussed. Present bands suggest the major presence of non-Saccharomyces yeasts, yeast-like strain A. pullulans is present in the minority and Saccharomyces yeasts are probably present too. The technique remains open for further optimization, particularly as regards the conditions of polymerase chain reaction.
|
|
|
Izolace DNA v kvalitě pro PCR z mléčných výrobků pro dětskou výživu
Mantlová, Jana ; Eva, Kvasničková (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na izolaci DNA v kvalitě pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a identifikaci probiotických bakterií mléčného kvašení, které byly izolovány z pěti mléčných výrobků pro dětskou výživu. DNA byla z hrubých lyzátů buněk výrobku izolována pomocí magnetických mikročástic P(HEMA-co-GMA). Metodou fenolové extrakce byla izolována DNA z hrubých lyzátů buněk kontrolních kmenů, která byla využita jako pozitivní kontrola. Pomocí metod PCR byly ve výrobcích identifikovány DNA rodu Bifidobacterium a druhů B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum a druhu Streptococcus thermophilus. Dosažené výsledky jsou v souladu s údaji deklarovanými výrobcem.
|
|
|
Využití magnetických mikročástic pro izolaci bakteriální DNA
Hrudíková, Radka ; Horák, Daniel (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na testování dvou typů magnetických mikročástic funkcionalizovaných –COOH skupinami pro izolaci bakteriální DNA. Izolace byla provedena z hrubých lyzátů buněk připravených z čisté kultury Lactobacillus paracassei RL-10, v prostředí 2 M NaCl a 16% PEG 6000. Dále byl sledován vliv degradace RNA enzymem RNasa A na množství izolované DNA. Bylo zjištěno, že degradace RNA v hrubých lyzátech buněk měla vliv na množství izolované DNA. Množství izolované DNA záleželo na použitých mikročásticích. Větší množství DNA bylo izolováno pomocí částic s větším obsahem –COOH skupin. Nosiči byla izolována DNA amplifikovatelná v PCR. V další části práce byly testovány nosiče funkcionalizované –NH2 skupinami při izolaci DNA s využitím elektrostatických sil. Bylo prokázáno, že pro vazbu DNA na nosič je vhodné prostředí s nižším pH.
|
|
|
Identifikace bakterií mléčného kvašení v tvrdých sýrech s využitím amplifikačních metod
Herzogová, Jitka ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Diplomová práce byla zaměřena na identifikaci bakterií mléčného kvašení druhu Lactococcus lactis a poddruhů Lactococcus lactis ssp. lactis a Lactococcus lactis ssp. cremoris pomocí druhově a subdruhově specifické polymerázové řetězové reakce (PCR). Metoda PCR byla použita k identifikaci bakterií druhu Lactococcus lactis v 10 vzorcích tvrdých sýrů. Byl vypracován postup přípravy vzorků tvrdých sýrů pro získání dostatečného množství buněk a přípravu hrubých lyzátů buněk. Celková DNA v kvalitě vhodné pro PCR byla izolována použitím magnetických částic P(HEMA-co-GMA) v přítomnosti polyethylenglykolu (PEG 6000) a chloridu sodného. Jako kontrola izolace byla použita DNA izolovaná metodou fenolové extrakce. PCR byla rovněž použita k analýze 7 kmenů Sbírky mlékařských mikroorganismů Laktoflora (CCDM). U těchto kmenů bylo subdruhově specifickou PCR prokázáno zařazení 5 kmenů do poddruhu Lactococcus lactis ssp. lactis a 2 kmenů do poddruhu Lactococcus lactis ssp. cremoris.
|
|
|
Využití magnetických částic při izolaci DNA z výrobků z obilovin
Starenkova, Anastasiia ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Diplomová práce byla zaměřena na testování mikroizolace DNA za pomocí magnetických částic z ereálních výrobků v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Pro analýzu byly vybrány cereální sušenky a výrobky pro děti. Vzorky byly homogenizovány s použitím plastového kopistu v lyzačním roztoku s cetyltrimetylammonium bromidem (CTAB). Homogenáty byly purifikovány směsí chloroform-oktanol. Při přípravě homogenátu byl také testován vliv isopropanolu. Homogenáty byly použity pro izolaci DNA magnetickými částicemi. Byly testovány dva spůsoby separace magnetických částic s navázanou DNA (magnetický separátor a magnetická jehla). Izolovaná DNA byla analyzována spektrofotometricky - byla zjišťována její koncentrace a čistota. Poté byla ověřována amplifikovatelnost DNA v PCR. Pro amplifikaci byly použity dvě sady primerů specifických pro rostlinnou ribosomální DNA. Produkty PCR s očekávanou délkou 700 a 220 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Bylo zjištěno, že DNA izolovaná ze zrn cereálií, nakličených zrn a cereálních výrobků pomocí testovaných magnetických nosičů byla v kvalitě vhodné pro PCR.
|
|
|
Detekce patogenů lilku bramboru přenosných sadbou
Bačová, Nikola
Tato bakalářská práce se zaměřuje na patogeny lilku bramboru přenosné sadbou a metody stanovení těchto patogenů prostřednictvím polymerázové řetězové reakce (PCR). V práci jsou popsány metody detekce patogenů Rhizoctonia solani a Helminthosporium solani. Oba patogeny, jak Rhizoctonia solani, tak i Helminthosporium solani, jsou významnými patogeny lilku bramboru, ovlivňující vzhled a prodejnost hlíz a zároveň omezující použití napadené sadby. Pro patogen Rhizoctonia solani byla optimalizována metodika detekce a kvantifikace pomocí real-time polymerázové řetězové reakce (qPCR) za použití primerů ARSF4/R4 a pro patogen Helminthosporium solani byla optimalizována metodika detekce pomocí qPCR za použití primerů Hs1NF1/Hs2NR1.
|
|
|
Detekce patogenů lilku bramboru přežívajících v půdě
Valkovičová, Nikola
Bakalářská práce se zabývala detekcí a sekvenací patogenů lilku bramboru přežívajících v půdě. Pozornost je věnována především patogenům rodu Fusarium. Tyto patogeny způsobu-jí suchou hnilobu brambor, která vytváří povlaky bílého mycelia a hlíza následně mumifikuje, není vhodná ke konzumaci a snižuje se výnos. Pro detekci patogenů byla zvolena jedna z nejpřesnějších metod – PCR. Pro detekci pato-genů rodu Fusarium z infikovaných bramborových hlíz byla použita konvenční PCR s nespecifickými primery ITS4 a ITS5 nasedající do oblasti mezi geny, které kódují RNA ITS4 a ITS5. Pro detekci patogenů z půdy byla zvolena real–time PCR s primery ITS1F a AFP346 nasedající do oblasti, které kódující nRNA a mezerníky ITS1 a ITS2. Testovaná půda byla uměle inokulována neznámým izolátem rodu Fusarium získaným z bramborové hlízy a sbírkovým izolátem Fusarium solani var. coeruleum. Sekvenace potvrdi-la infekci hlízy bramboru patogenem Fusarium culmorum a objasnila tak obtížnost kvantifika-ce.
|
|
|
Vliv typu matrice na stanovení autenticity potravin obsahujících ovocnou složku
Kopková, Pavlína ; Strečanská, Paulína (oponent) ; Fialová, Lenka (vedoucí práce)
Některé druhy potravin, převážně ty dražší, bývají často falšovány za účelem snížení jejich výrobní ceny. Tím se snižuje jejich kvalita a mohou mít i negativní vliv na zdraví konzumenta. Terčem podvodných výrobců jsou i dětské ovocné výrobky, kde je nejčastěji nahrazováno deklarované ovoce levnější variantou. Tato práce je zaměřená na odhalování falšovaných potravin pomocí různých analytických metod, zejména metodou PCR. Teoretická část je zaměřena na problematiku falšování potravin, na analytické metody, které jsou pro odhalování falšování používané a také na mango a banán, které jsou v této práci stanovovány [1]. Cílem práce bylo stanovit vliv typu matrice na stanovení ovocné složky v potravinách metodou PCR. Pro tento účel byly použity tři typy matrice – ovocné pyré, smoothie a tyčinky. Důležitým úkolem bylo optimalizovat izolaci DNA, aby bylo dosaženo odpovídající čistoty a koncentrace DNA. Poté byla stanovena amplifikovatelnost získané DNA. Tato DNA byla následně analyzována pomocí duplex PCR s primery specifickými pro banán a mango. Výsledky byly ověřovány agarózovou gelovou elektroforézou. Následně bylo možné určit, že nejlépe se stanovuje ovocná složka v tyčinkách a čerstvém smoothie, a naopak problematické stanovení je u pyré. Instrumentální část byla zaměřena na stanovení fenolických látek ve výrobcích metodou HPLC. Pro tento účel byla nutná optimalizace extrakce fenolických látek. Touto metodou se podařilo detekovat přítomnost manga ve všech vzorcích.
|
|
|
Problematika cytomegalovirové infekce u transplantovaných pacientů.
Dvořák, Jan ; Tachezy, Ruth (vedoucí práce) ; Harant, Karel (oponent)
Cytomegalovirus (HCMV ) je běžný lidský -herpesvirus, který vykazuje vysokou prevalenci v populaci. K přenosu dochází těsným kontaktem mezi osobami, u kterých způsobuje převážně asymptomatickou primární infekci, která poté přechází v latentní infekci. Problémy tento virus způsobuje během těhotenství, kde může způsobit potraty, defekty plodu a vrozené defekty novorozenců. Mnohem větším nebezpečím je infekce tímto virem u imunokompromitovaných pacientů převážně u pacientů s infekcí HIV a u transplantovaných pacientů. Tato práce je komplexním pojednáním o biologii HCMV se zaměřením především na rizika, která HCMV způsobuje u pacientů po orgánové transplantaci a transplantaci hematopoetických kmenových buněk, včetně přehledu metod používaných pro diagnostiku a monitorování HCMV infekce a možností prevence vzniku HCMV asociovaných onemocnění. Klíčová slova: Cytomegalovirus, transplantace hematopoetických kmenových buněk, orgánová transplantace, detekce, monitorování, polymerázová řetězová reakce, buněčná imunita, protilátková imunita
|
host ::
RSS.