|
| |
|
|
Příprava reportérové buněčné linie pro ověření biologické aktivity rekombinantních proteinů
Kozojedová, Petra ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky patří mezi imunitní buňky zprostředkovávající nespecifickou imunitní odpověď organismu. Exprimují na svém povrchu řadu ligand-specifických aktivačních či inhibičních receptorů, mezi které patří přirozeně cytotoxický aktivační receptor NKp30, indukující po interakci s ligandem cytotoxickou odpověď. Receptor NKp30 má jednu ligand vazebnou imunoglobulinu podobnou extracelulární doménu s krátkou "stalk" doménou, která umožňuje oligomerizaci extracelulární domény receptoru NKp30, což vede k posílení interakce ligand- receptor a ovlivnění signalizace vedoucí k aktivaci buňky. Tato práce se zabývá přípravou konstruktů inspirovaných technologií chimerních antigenních receptorů nesoucích extracelulární doménu receptoru NKp30 se "stalk" doménou či pouze ligand vaznou doménu pro ověření biologické aktivity konstruktů po expresi na buněčné membráně. Byly připraveny dva vektory pro expresi konstruktů inspirovaných chimerními antigenními receptory s geny pro extracelulární doménu receptoru NKp30. Pro ověření biologické aktivity různých konstruktů byla plasmidová DNA kódující připravené konstrukty transientně transfekována do buněk Jurkat. Klíčová slova: NK buňky, NKp30, reportérová buněčná linie, rekombinantní protein, chimerní antigenní receptor
|
|
|
Příprava rekombinantních forem extracelulární domény myších leukocytárních receptorů z rodiny NKR-P1.
Adámek, David
Myší receptory NK buněk patřící do rodiny NKR-P1 hrají roli v regulaci odpovědi těchto buněk z hlediska jejich aktivace, inhibice a produkce cytokinů. Tato diplomová práce se zabývá přípravou extracelulárních částí aktivačních receptorů mNKR-P1A a mNKR-P1C z myšího kmene C57BL/6. Cílem bylo připravit produkční vektor obsahující kódující sekvenci příslušných částí obou receptorů, optimalizovat jejich produkci v bakteriích E. coli a nalézt vhodný postup jejich renaturace a purifikace in vitro. Čisté proteinové preparáty byly následně ověřeny a analyzovány hmotnostní spektrometrií a rovněž značeny fluorescenční značkou za účelem hledání ligandu na buněčných preparátech. V budoucím výzkumu bude řešena struktura připravených proteinových preparátů a rovněž budou použity k hledání svých ligandů. Dané poznatky mohou v budoucnu dopomoci k lepšímu pochopení NK buněk.
|
|
|
Vliv bezlepkové diety na populace imunitních buněk na NOD myším modelu diabetu 1. typu
Tejklová, Tereza ; Funda, David (vedoucí práce) ; Krulová, Magdaléna (oponent)
Diabetes 1. typu (T1D) je autoimunitní onemocnění, které vede k destrukci inzulín produkujících β buněk v pankreatu. Faktory prostředí, jako např. expozice infekcím nebo složky diety, hrají podstatnou úlohu v etiopatogenezi T1D. V posledních desetiletích jsou navíc zodpovědné za prudký nárůst incidence T1D, a to především ve vyspělých zemích. Navzdory dlouhodobému výzkumu neexistuje kauzální léčba ani účinná prevence T1D. Zatímco účinky lepku jsou prozánětlivé, bezlepková dieta (gluten-free, GFD) byla dokumentována mnoha skupinami jako faktor prostředí, který výrazně snižuje incidenci T1D u spontánních zvířecích modelů T1D, především u NOD myší. Cílem této diplomové práce bylo lépe charakterizovat vlivy GFD diety na imunitní systém NOD myší. Pomocí průtokové cytometrie jsme studovali vliv standardní a GFD Altromin diety na populace NK buněk, regulačních a potenciálně regulačních T lymfocytů a jejich cytokinové profily u prediabetických SPF NOD samic, které byly vystaveny dietám již prenatálně. Vliv GFD na rozvoj diabetu jsme testovali adoptivním přenosem splenocytů, izolovaných z 12týdenních NOD myší, do NOD-SCID myšího modelu. Ověřili jsme diabetes protektivní efekt GFD u SPF NOD samic chovaných v našich podmínkách a na NOD-SCID modelu přenosu diabetu dokumentovali, že expozice GFD vede k nižší...
|
|
|
Interaction of Galectin-1 with human NK cell receptors
de Sousa Santos Abreu, Celeste ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Přirozeně zabíječské buňky (z anglického natural killer cells) jsou subpopulace efektorových lymfocytů, které mají cytotoxickou aktivitu a schopnost produkovat cytokiny, považované za nedílnou součást vrozené imunitní odpovědi. Funkce NK buněk zahrnují eliminaci nádoru, zapojení a regulaci antivirových imunitních odpovědí a regulaci imunitních buněk produkcí a sekrecí chemokinů a cytokinů. CD69 je transmembránový receptor podobný lektinům typu C exprimovaný v NK buňkách. CD69 je aktivačním receptorem NK buněk a slouží jako velmi časný marker aktivace lymfocytů. V posledních letech byly popsány předpokládané proteinové ligandy CD69: Galektin-1, S1P1, S100A8/S100A9 a Myl9/12. Galektin-1 je typický lektin charakterizovaný přítomností společného lektinového strukturního motivu a domény rozpoznávající a podílející se na vazbě sacharidů. Galektin-1 byl identifikován jako vazebný partner pro CD69 na základě biologických a funkčních studií, ale strukturální podrobnosti o komplexu stále chybí. Tato práce popisuje úspěšné zavedení protokolu pro expresi mutované formy galektinu- 1 neobsahující cysteiny ani purifikační kotvu a studium interakce mezi galektinem-1 a receptory NK buněk. Interakce byla studovaná mikrotermoforézou a byla popsána jako závislá na přítomnosti N-vázané glykosylace na povrchu receptoru....
|
|
|
NK buňky a KIR receptory: jejich význam v transplantacích hematopoetických kmenových buněk u leukemií
Ledvinková, Anna ; Vraná, Milena (vedoucí práce) ; Pačes, Jan (oponent)
NK buňky a KIR receptory: jejich význam v transplantacích hematopoetických kmenových buněk u leukemií Abstrakt Tato bakalářská práce pojednává o významu NK (natural killer) buněk u leukémií. Je zaměřena na strukturu a reaktivitu NK buněk, a především pak na transmembránové KIR receptory (killer cell immunoglobuline-like receptors) NK buněk, které hrají důležitou roli v likvidaci leukemických buněk (reakci štěpu proti leukemii, GvL) a tedy v celkové prognóze nemoci. Aktivační a inhibiční receptory KIR svou kooperací řídí cytotoxickou aktivitu NK buněk. Typizací genů pro KIR receptory u dárců hematopoetických kmenových buněk tak lze předpovědět úspěšnost léčby. Vyšetření genů KIR se využívá především u pacientů diagnostikovaných akutní myeloidní leukémií. Klíčová slova: KIR receptor, NK buňky, transplantace hematopoetických kmenových buněk, HSCT, leukémie, donor, recipient
|
|
| |
|
|
Vliv mutace S159A na oligomerní stav NKR-P1A receptoru lidských NK buněk
Hausleitner, Filip ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kožíšek, Milan (oponent)
Přirozeně zabíječské buňky (NK buňky) jsou lymfocyty schopné ničit nádorové a viry infikované buňky bez předešlé antigenní senzitizace. Využívají k tomu svoje aktivační a inhibiční povrchové receptory, které interagují s povrchovými molekulami cílových buněk. Imunitní odpověď NK buněk závisí na celkovém součtu signálů z obou typů receptorů. Receptor NKR-P1A lidských NK buněk patří do strukturní rodiny receptorů podobných lektinům C-typu. Tento receptor interaguje s jeho ligandem LLT1 ze stejné proteinové rodiny, přičemž tato interakce je charakterizována nízkou afinitou a vysokou specifitou. Vytvoření komplexu NKR-P1A:LLT1 mezi NK buňkou a cílovou buňkou inhibuje cytotoxicitu NK buňky, a tak je součástí regulace imunitní odpovědi. V této práci byl studován vliv mutace S159A na oligomerní stav rozpustné ektodomény lidského NKR-P1A v roztoku. Pro tento účel byla úspěšně rekombinantně připravená mutantní forma rozpustné ektodomény lidského NKR-P1A G90-S225 S159A ve stabilně transfekovaných lidských embryonálních ledvinných buňkách 293 (HEK293S GnTI" ). Připravený konstrukt byl purifikován pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie a následně analyzován pomocí SDS-PAGE a sedimentační analýzy. Výsledky potvrzují, že absence N-vázané glykosylace v pozici 157 podporuje dimerizaci ektodomény v...
|
|
|
Příprava nádorového ligandu B7-H6 s coiled-coil kotvou a ověření jeho vazby na receptor NKp30
Krejčová, Kateřina ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky jsou přirozené zabíječské buňky (z angl. natural killer cells) podílející se na protinádorové imunitě. Tyto buňky jsou schopny zabránit vzniku virové infekce či nádorového onemocnění, a to bez předešlé senzitizace antigenem. Mechanismus aktivace NK buněk je založen na principu snížené exprese MHC gp I molekul na povrchu nádorových buněk. Na povrchu NK buněk jsou přítomny receptory, které jsou schopny rozlišit jak aktivační, tak inhibiční signály, které rozhodují o tom, zda dojde k aktivaci NK buněk a zabití cílové buňky, či nikoliv. NKp30 je transmembránový receptor I. typu, který rozeznává stresem indukovaný buněčný ligand B7-H6. Interakce těchto proteinů je signálem pro imunitní systém k zahájení imunitní odpovědi. Tato práce se zaměřuje na přípravu buněčného ligandu B7-H6 s peptidovou coiled- coil kotvou v liniích lidských embryonálních ledvinných buněk HEK293S GnTI- a HEK293T. Byl úspěšně připraven protein s coiled-coil kotvou na C-konci proteinu, což bylo ověřeno hmotnostní spektrometrií. Rovněž byla pomocí sedimentační analýzy potvrzena interakce připraveného proteinu s receptorem NKp30. Klíčová slova: NK buňky, rekombinantní exprese, B7-H6, HEK293, coiled-coil
|
|
|
Vliv obezity na funkci imunitního systému se zaměřením na NK buňky
Císařová, Radka ; Krulová, Magdaléna (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Obezita má negativní důsledky na zdraví lidí a v dnešní době se rozmáhá i v rozvojových zemích. Za příčinu negativního vlivu obezity se považuje chronický zánět vznikající ve viscerální tukové tkáni. Nejvýznamnější změnou ve viscerální tukové tkáni, z hlediska rozvoje zánětu, je indukce M1 fenotypu makrofágů a jejich následná akumulace. Nicméně prvotní impuls, který vede k těmto změnám je nejednoznačný. Za jednu z možností se považuje i změna fenotypu a aktivace NK buněk. Obezita narušuje hlavní funkci NK buněk spočívající v lýzi virem infikovaných nebo rakovinových buněk. Leptin, jehož množství je při obezitě chronicky zvýšeno, má na NK buňky dvojí efekt. Krátkodobé působení leptinu zvyšuje jejich cytotoxicitu a naopak dlouhodobé působení ji snižuje. Současné studie fenotypu NK buněk ve viscerální tukové tkáni poukazují na zvýšenou produkci INF- a expresi NKG2D v NK buňkách. Studium NK buněk v kontextu obezity a hlavně v kontextu viscerální tukové tkáně obézních jedinců je důležité pro pochopení negativních účinků obezity.
|
host ::
RSS.