|
Nové markery vývoje kolorektálního karcinomu u ulcerózní kolitidy
Švec, Jiří ; Kment, Milan (vedoucí práce) ; Keil, Radan (oponent) ; Hampl, Aleš (oponent)
SOUHRN Úvod: Dlouhotrvající ulcerozní kolitida (UC) je spojena se zvýšeným rizikem vývoje kolorektálního karcinomu (CRC) a zvýsená exprese cyklooxygenázy 2 (COX-2), inducibilní NO syntázy (iNOS), survivinu, telomerázové katalytické podjednotky (TERT), integrinové kinázy (ILK) a transkripčních faktorů c-MYB a TCF-4 byla prokázána během sporadické kolorektální tumorigeneze. Nicméně změny v expresi těchto proliferačních a antiapoptotických genů během neoplastické transformace u ulcerozní kolitidy nejsou dostatečně popsány. Metody: Analyzovali jsem genovou expresi těchto markerů během přechodu epitelu tlustého střeva od chronickým zánětem iritované mukozy k epiteliální neoplasii v biopsiích pacientů s UC pomocí kvantitativní RT-PCR a imunohistochemie a porovnali jsme změny genové exprese studovaných markerů také ve vzorcích získaných od pacientů operovaných pro sporadický kolorektální karcinom a v xenograftových vzorcích odvozených od nádorové linie SW620. Dále jsme studovali expresi mRNA těchto genů také s využitím laserové mikrodisekce u myšího modelu s kolitidou asociované (kmen ICR) i sporadické kolorektální karcinogeneze (kmen A/J). Výsledky: Hladiny mRNA pro survivin, c-MYB, COX-2, iNOS a TCF-4 byly signifikantně zvýšeny během neoplastické transformace epitelu u pacientů s ulcerozní kolitidou, naopak TERT...
|
|
Vliv extracelulární matrix na expresi genů jaterních myofibroblastů
Jiroutová, Alena ; Kanta, Jiří (vedoucí práce) ; Ehrmann, Jiří (oponent) ; Sedláček, Radislav (oponent)
SOUHRN Jaterní hvězdicové buňky (HSC) a jaterní myofibroblasty (MF) jsou považovány za buňky odpovědné za syntézu extracelulární matrix (ECM). HSC a MF se liší lokalizací v jaterním lalůčku i expresí genů. HSC se nacházejí v Disseho prostoru, při poškození jater se aktivují, proliferují a přeměnují se na myofibroblastické buňky. MF jsou heterogenní skupina buněk, byly popsány portální pMF, septální sMF a interface iMF. V portobiliárním prostoru jaterního lalůčku se nacházejí pMF, které se aktivují při ischemii a městnání žluči; sMF se nacházejí uvnitř vazivových sept. Cílem naší práce bylo porovnat změny exprese genů, které provázejí aktivaci HSC in vitro se změnami odehrávajícími se v HSC při vzniku jaterní cirhózy v modelu toxického poškození jater. Expresi vybraných genů jsme sledovali pomocí oligo cDNA arrayí zahrnujících geny kódující proteiny, proteoglykany, cytokiny, růstové faktory a geny související s metabolismem pojiva - metaloproteinasy (MMP). Zajímali jsme se také o chování MF v trojrozměrném kultivačním prostředí - fibrinovém a kolagenním gelu, které lépe simuluje podmínky ve fibrotických játrech. Poškozená jaterní tkáň je nahrazována nejdříve plasmatickým fibrinem a posléze je nahrazena jizvou s převahou kolagenu. Chování a exprese genů MF v trojrozměrném kultivačním prostředí, nebyla dosud...
|
|
Genetic factors in aetiology and phatogenesisof low gamma-glutamyltransferase cholestasis and hereditary jaundice
Cebecauerová, Dita ; Jirsa, Milan (vedoucí práce) ; Brdička, Radim (oponent) ; Macek, Milan (oponent)
Souhrn (Česky) Identifikace genů kódujících hepatocelulární přenašeče a funkční charakterizace jednotlivých proteinů v posledním desetiletí umožnily vedle zrychlení a zpřesnění diagnostického procesu cholestázy i bližší studium regulace genové exprese a tím potenciální možnosti jejího ovlivnění. Tato práce ilustruje současný pokrok na poli geneticky podmíněných cholestáz a zaměřuje se na cholestázy s nízkou hladinou gammaglutamyltransferázy (γGT) a dědičně podmíněné žloutenky. Studie popisuje různé poruchy transportního systému hepatocytů, charakterizuje mutace a jejich fenotypické následky a rozšiřuje tyto analýzy o podrobnou charakterizaci regulačních oblastí genu ATP8B1. Oddíly týkající se cholestáz s nízkou hladinou gammaglutamyltransferázy - popisují vzácný nalezený typ inserčně-deleční mutace asociované s benigním průběhem progresivní familiární intrahepatální cholestázy 1. typu a diskutují možný mechanismus vzniku mutace a její pravděpodobný vliv na funkci proteinu FIC1. - shrnují rozsáhlou genetickou analýzu pacientů se závažnou formou progresivní intrahepatální cholestázy 2. typu, podmíněnou mutacemi v BSEP (Bile Salt Export Pump). Studie se zabývá korelací genotypu a fenotypu u 109 postižených rodin, diskutuje vliv jednotlivých mutací, zejména typ, lokalizaci a stupeň konzervace, na...
|
|
Laboratorní diagnostiky mikrometastáz u pacientek s karcinomem prsu
Mikulová, Veronika ; Zima, Tomáš (vedoucí práce) ; Svoboda, Marek (oponent) ; Průša, Richard (oponent)
Úvod: Přítomnost cirkulujících nádorových buněk (CTC) v periferní krvi je asociována s horší prognózou a časným relapsem u pacientek s karcinomem prsu. Stanovení přítomnosti CTC v periferní krvi je nyní považováno za tzv. tekutou biopsii. Cílem této práce bylo stanovení přítomnosti CTC a jejich molekulární charakterizace s potenciálním využitím nejen jako nový biomarker pro sledování účinnosti systémové terapie ale také jako vhodný nástroj pro stratifikaci pacientek a následnou individualizaci léčby karcinomu prsu. Metody: Do prospektivní studie bylo zařazeno 54 pacientek s časným karcinomem prsu. Opakovaně jsme odebírali 10ml periferní krve pro stanovení přítomnosti a charakterizaci CTC v průběhu léčby. Izolace a detekce CTC byla provedena za použití AdnaTest BreastCancer™ kitu (AdnaGen AG, Německo) využívající kombinaci imunomagnetické separace s multiplex PCR pro stanovení transkriptů epiteliálních a tumor-asociovaných genů (EpCAM, MUC1 a HER2) v lyzátu CTC. Následně byla cDNA z izolovaných CTC použita pro analýzu genových expresí TOP1, TOP2A, CSTD, ST6GAL, KRT19 a aktin pomocí nově navržených a optimalizovaných esejí pomocí kvantitativní PCR (qPCR). Výsledky qPCR byly analyzovány pomocí softwaru Genex (MultiD Analysis). Výsledky: Celkem jsme vyšetřily 195 vzorků periferní krve. Přítomnost CTC...
|
|
Laboratorní diagnostika Clostridium difficile
JANDOVÁ, Romana
Clostridium difficile s produkcí toxinů je nejčastějším původcem nozokomiálních střevních infekcí. Způsobuje zánětlivé onemocnění tračníku nazývané Clostridium difficile infection (CDI) různé závažnosti - od banálního průjmu až po život ohrožující stav jako je paralytický ileus a toxické megakolon. C. difficile stále ještě uniká pozornosti laické veřejnosti a stojí v pozadí za jinými bakteriemi, jako je např. MRSA. Clostridium difficile je striktně anaerobní bakterie. Je to grampozitivní tyčinka tvořící oválné subterminální spóry. C. difficile může produkovat dva typy toxinů - a to toxin A (enterotoxin) a toxin B (cytotoxin). Vlivem toxinů dochází k poškození střevního epitelu i hlubších vrstev střevní stěny. Vznikají zánětlivé ulcerace, které se pokrývají pseudomembránami. Některé kmeny produkují ještě binární toxin, jehož přesná funkce zatím není objasněna. Předpokládá se, že potencuje účinek toxinů A a B zvyšováním jejich koncentrace. K průkazu CDI je nutné odebrat vzorek stolice do sterilní zkumavky. Na Pracovišti bakteriologie Nemocnice České Budějovice, a.s. se provádí přímý průkaz antigenu a toxinu imunochromatografickou metodou. Jedná se o membránovou enzymovou imunoanalýzu pro detekci antigenu - glutamát dehydrogenázy (GDH) a toxinu A/B. Negativní výsledek GDH vyloučí s velkou spolehlivostí klostridiovou infekci. Za potvrzenou CDI se považuje průkaz toxigenního kmene C. difficile. To je zřejmé buď přímo z výsledku imunochromatografie, kdy se prokáže zároveň antigen i toxin, nebo průkazem genu pro toxin B metodou PCR. Pokud totiž vyjde v přímém průkazu pozitivní pouze antigen, vzorek se zasílá na PCR vyšetření do Laboratoře molekulární biologie a genetiky. Nezávisle na výsledku imunochromatografie se ze stolice zhotovuje mikroskopický preparát obarvený podle Grama. V případě prokázaného toxinu C. difficile se provádí anaerobní kultivační vyšetření, které trvá dva dny. K identifikaci narostlých bakterií se používá nejčastěji latexová aglutinace. Jde o metodu, kdy se IgG protilátky navázané na latexových partikulích specificky vážou k antigenům buněčné stěny. K identifikaci bakterie lze použít též přístroj VITEK - MS, který používá metodu ionizaci laserem za přítomnosti matrice s následnou hmotnostní spektrometrií. V případě pozitivního kultivačního nálezu Clostridium difficile se z narostlé kultury stanovuje citlivost k antibiotikům pomocí E-testu a diskové difuzní metody. Za rok 2011 bylo na Pracoviště bakteriologie vyšetřeno 291 vzorků stolic. Z nich mělo v imunochromatografickém vyšetření 13,4 % pozitivní antigen i toxin; 15,1 % pozitivní antigen a negativní toxin a 71,5 % bylo negativních. U 74 vzorků byl prokázán toxin C. difficile. U těchto vzorků bylo následně provedeno i kultivační vyšetření - pozitivní bylo v 62,2 %. Nejvíce pozitivních vzorků bylo odesláno z Infekčního oddělení. V počtu vyšetřených pacientů převažovaly ženy, bylo jich 53,6 % a mužů 46,4 %. Procentuální zastoupení toxigenních kmenů bylo u obou pohlaví prakticky totožné - 25 %. Všechny kmeny byly citlivé k vankomycinu a pouze jeden kmen byl rezistentní k metronidazolu.
|
|
Studie molekulárních markerů korelujících s prognózou a výsledkem terapie kolorektálního karcinomu.
Protivová, Martina ; Souček, Pavel (vedoucí práce) ; Hromadníková, Ilona (oponent)
Kolorektální karcinom je jedním z nejčastějších onkologických onemocnění u nás i ve světě. Závažným problémem v léčbě tohoto onemocnění je interindividuální variabilita v odpovědi na léčbu, neboť velká část pacientů vykazuje rezistenci nebo závažnou toxicitu k léku. Příčinou takové variability může být genetická výbava jedince. Z tohoto hlediska stoupá potřeba nalezení molekulárních markerů prognózy průběhu onemocnění a markerů, díky kterým budeme schopni odhadnout reakci pacienta na léčbu. Hlavním cílem této studie bylo najít rozdíly v expresi genů mezi zdravou a nádorovou tkání u pacientů dobře a špatně odpovídajících na léčbu na bázi 5-fluorouracilu a zjištěné výsledky porovnat ve vztahu ke klinickým datům. Tato studie se zaměřila na hodnocení genové exprese 14 potenciálních molekulárních markerů zapojených do drah 5-FU zahrnujících metabolismus, transport a cíle tohoto léku. Do studie byli vybráni pacienti léčeni režimy na bázi 5-FU. Exprese byla hodnocena na dvou nezávislých souborech tvořených pacienty s indikovanou paliativní nebo adjuvantní chemoterapií. Od každého pacienta byla k dispozici nádorová a párová nenádorová tkáň Genová exprese v těchto vzorcích byla měřena pomocí real-time RT-PCR s relativní kvantifikací za použití preamplifikované cDNA. V první fázi byla genová exprese...
|
|
Vliv polymorfismu NKR-P1 na expresi receptorů Ly49 u hybridních kmenů myší (C57BL/6 x Balb/c, F10-F12)
Holubová, Martina ; Fišerová, Anna (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Vliv polymorfismu NKR-P1 na expresi receptorů Ly49 u hybridních kmenů myší (C57BL/6 x Balb/c, F10-12) Abstrakt Přirozené zabíječské (NK) buňky tvoří subpopulaci velkých granulárních lymfocytů, které zprostředkovávají spontánní imunitní odpověď proti nádorovým a mikroorganismy infikovaným buňkám a představují tak důležitou součást vrozené imunity. Na povrchu NK buněk je exprimována široká škála aktivačních a inhibičních povrchových receptorů, jejichž prostřednictvím NK buňky rozpoznávají abnormální buňky; cytolytická aktivita je regulována na základě rovnováhy aktivačních a inhibičních signálů. K nejvýznamnějším rodinám receptorů myších NK buněk patří rodiny NKR-P1 a Ly49, které spadají do C-lektinové superrodiny receptorů kódované NK-genovým komplexem (NKC) na chromosomu 6 a zahrnují jak aktivační, tak inhibiční členy. Hlavním cílem této diplomové práce bylo ověřit vliv polymorfismu Nkr-p1c na expresi receptorů Ly49 a zjistit, zda se clustery genů Ly49 a Nkr-p1 lokalizované na opačných koncích NKC domény dědí nezávisle na sobě, či zda je na potomstvo přenášena celá NKC doména. Dalším cílem bylo zmapovat vliv zmíněného polymorfismu na cytotoxicitu NK buněk a růst nádorů. Pro tento účel byly použity myši inbredních kmenů C57BL/6 a Balb/c a jejich hybridi 10.-12. dceřinné generace. Genomy myší zmíněných kmenů...
|
|
Porovnání sekvenčních variant genů pro biotransformační enzymy u různých typů karcinomů
Turková, Lucie ; Tavandzis, Spiros (oponent) ; Bóday, Arpád (vedoucí práce)
Biotransformační aparát a jeho kapacita hrají významnou roli ve vyrovnávání se s environmentálními faktory negativně působícími na buněčné struktury. Enzymy účastnící se tohoto procesu jsou v závislosti na genech, které je kódují, různě účinné. Cílem práce bylo srovnat frekvence konkrétních polymorfismů vybraných genů u nádorových skupin pacientů a u zdravých kontrol. Sledovanými polymorfismy byly null genotypy genů pro glutathion-S transferázu M1 a T1 a inzerce TA dinukleotidu v promotorové sekvenci genu pro UDP-glukuronosyl transferázu 1A1. Nádorových skupin, kde byly tyto polymorfismy sledovány, bylo celkem šest - kolorektální karcinomy, karcinomy plic, prostaty, prsu, pankreatu a hlavy a krku. Celkem byly zmíněné polymorfismy vyšetřeny na 1 118 pacientech a 470 zdravých kontrolách. Kontrolní skupiny byly dvě - první obecná a druhá speciální, do které byli zařazeni pouze zdraví jedinci starší šedesáti let bez výskytu nádorového onemocnění u jejich nejbližších příbuzných. Gilbertův syndrom (GS), jehož příčinou je homozygotní inzerce TA dinukleotidu v sekvenci TATA boxu promotorové oblasti UGT1A1, má za následek zvýšenou hladinu celkového bilirubinu v krvi. Cílem bylo ověřit, zda má bilirubin protektivní účinek proti vzniku nádorového onemocnění. Bylo očekáváno, že frekvence Gilbertova syndromu, jakožto protektivního faktoru, bude u nádorových skupin statisticky významně nižší než u zdravých kontrol. Tato hypotéza se potvrdila pouze u pacientů s nádorem prsu (frekvence GS 10,0 %) a u pacientů s nádory pankreatu (frekvence GS 11,1 %). V kontrolní skupině I byla frekvence GS 16,0 %, v kontrolní skupině II pak 15,4 %. U ostatních nádorových skupin byla sice frekvence GS vždy nižší oproti kontrolním skupinám, ne však statisticky významně. Null genotyp genu pro GSTM1 byl v kontrolní skupině I zjištěn u 50,4 % jedinců, v kontrolní skupině II u 55,3 % jedinců. Žádná z nádorových skupin nevykazovala statisticky vyšší frekvenci výskytu tohoto null genotypu. U pacientů s nádory plic (37,4 %) a pankreatu (39,3 %) byla naopak frekvence statisticky významně nižší. Deficience enzymu glutathion-S transferázy M1 tak dle těchto výsledků nemůže být považována ve studovaných skupinách za rizikový faktor pro vznik nádorového onemocnění. Null genotyp genu pro GSTT1 nebyl identifikován v žádné z kontrolních skupin, ve skupině s nádory prsu a prostaty byl pak identifikován pouze v jednom případě. Statisticky významně vyšší frekvence null genotypu byla pozorována u pacientů s kolorektálním karcinomem (9,7 %), karcinomem plic (17,2 %), karcinomem pankreatu (3,0 %) a karcinomem hlavy a krku (15,9 %). V těchto nádorových skupinách tak lze deficienci glutahion-S transferázy T1 považovat za rizikový faktor pro nádorovou transformaci buněk. Pro další potvrzení této hypotézy by však bylo vhodné provézt vyšetření na větší skupině pacientů, zejména pak u nádorů hlavy a krku, plic a pankreatu.
|
|
Imunologicko-biologické aspekty spinocelulárních karcinomů v oblasti hlavy a krku
Bouček, Jan ; Říhová, Blanka (vedoucí práce) ; Fučíková, Terezie (oponent) ; Šlapák, Ivo (oponent)
Vznik nádorového onemocnění je podmíněn změnou či sérií změn na genové úrovni. Rozvoj nádorového onemocnění je do značné míry touto změnou předznamenán, ale velmi významnou roli zde hrají další okolnosti. V případě solidních nádorů se jedná hlavně o nádorové mikroprostředí. Zde se setkávají samotné nádorové buňky s buňkami okolního stromatu, zejména fibroblasty, a s buňkami imunitního systému. Zde se také zásadním způsobem formuje charakter a intenzita protinádorové imunitní odpovědi. Spinocelulární karcinom hlavy a krku je 6. nejčastější onkologické onemocnění postihující každoročně celosvětově více než půl milionu pacientů. Přes pokroky a zlepšení ve všech léčebných modalitách nedosahuje terapie ani v západních zemích uspokojivých hodnot a již několik desetiletí setrvávají na přibližně stejných hodnotách. V současné době je pravděpodobnost přežití 5 let, bez ohledu na lokalizaci a stádium onemocnění, jen přibližně 40%. V předložené práci jsou diskutovány imunologické a biologické aspekty spinocelulárních karcinomů hlavy a krku shrnující poslední poznatky o molekulární podstatě chování nádorových buněk, o vlivu a významu regulace imunitního systému pro klinický průběh onemocnění, a o moderních terapeutických přístupech.
|
|
HIV - 1 Protease: Insights into Drug Resistance Development
Grantz Šašková, Klára ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent) ; Dohnálek, Jan (oponent) ; Schiffer, Celia (oponent)
Aminokyselinové záměny v HIV proteáze či jejím substrátu, které snižují citlivost k proteázovým inhibitorům, představují celkem složitý problém, který není jasně charakterizován. Četné mechanismy, jakými mnohdy velmi komplikovaná skladba mutací ovlivňuje vazbu inhibitoru, musí nutně být analyzovány na molekulární úrovni, a to nejlépe sérií metod, počínaje experimenty s rekombinantními viry, enzymovými esejemi, strukturálními a termodynamickými studiemi či molekulární dynamikou. Každý výsledek pak může pomoci sestavit dohromady jakousi mozaiku evoluce vzniku rezistence k proteázovým inhibitorům, a tím se nepřímo podílet na vývoji ještě účinnějších léků tzv. třetí generace cílených proti HIV/AIDS. Tato dizertační práce představuje několik analýz zabývajících se vznikem rezistence u HIV viru právě na molekulární úrovni. Zaměřili jsme se konkrétně na evoluční dráhu vedoucí k rezistenci k proteázovému inhibitoru nelfinaviru, dále na tzv. lopinavirové mutační skóre, poté na výskyt aminokyselinových inzercí v genu HIV proteázy a jejich vliv na rezistenci k proteázovým inhibitorům a v neposlední řadě jsme analyzovali vysoce mutované varianty HIV proteázy izolované z pacientů, u kterých již nebyla účinná terapie darunavirem. Jelikož jsme byli schopni pracovat s širokou škálou technik, podařilo se nám...
|
host ::
