|
|
Účinek surfaktinu na lipidovou složku cytoplazmatické membrány Bacillus subtilis
Sklenářová, Petra ; Seydlová, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Surfaktin, sekundární metabolit produkovaný bakterií Bacillus subtilis, je povrchově aktivní látka a antibiotikum, které permeabilizuje membránovou dvouvrstvu. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, jaké adaptivní změny na úrovni lipidové složky cytoplazmatické membrány mohou přispívat k přežití B. subtilis v koncentracích surfaktinu, které bakterie jiných druhů zabíjí. Neprodukční kmen B. subtilis 168 byl kultivován v přítomnosti dvou různých subletálních koncentrací surfaktinu (350 a 650 µg/ml) izolovaného z kultury produkčního kmene B. subtilis ATCC 21332. Přídavek surfaktinu do média vedl v závislosti na koncentraci k zástavě růstu exponenciální kultury na 40 min (350 µg/ml), resp. 3 h (650 µg/ml) a poté se růst obnovil se změněnou dobou zdvojení. Nižší koncentrace způsobila 20% urychlení růstu, u vyšší naopak došlo k prodloužení doby zdvojení na dvojnásobek oproti kontrole. Surfaktin vyvolal v cytoplazmatické membráně zásadní změny ve složení fosfolipidů. Došlo ke snížení podílu majoritního fosfolipidu membrány fosfatidylglycerolu a naopak zvýšení podílu fosfatidyletanolaminu, u koncentrace surfaktinu stimulující růst se navíc výrazně navýšil podíl kyseliny fosfatidové. Měření kinetiky lyze lipozómů tvořených lipidy mimikujícími složení membrány vystavené surfaktinu prokázalo, že zvýšení...
|
|
|
Fenomén vzniku perzistence u bakterií - vliv toxin-antitoxin systémů.
Váchal, Martin ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Seydlová, Gabriela (oponent)
Většina současně studovaných bakteriálních druhů je schopna tvořit malou heterogenní frakci perzistentních buněk, tolerantních k řadě antibiotik, a přesto geneticky identických s citlivou mateřskou populací. Bakteriální perzisteři vznikají stochastickou regulací buněčných procesů buďto po indukci vnějším stresovým stimulem nebo spontánně i v podmínkách příznivých pro růst. Podle způsobu vzniku byli rozděleni na perzistery typu I a perzistery typu II. Mnoho recentních studií prokázalo uplatnění toxin-antitoxin (TA) systémů v perzistenci. TA systémy jsou běžně se vyskytující genetické elementy prokaryot. Sestávají se ze stabilního proteinového toxinu, inhibujícího určitý esenciální buněčný proces, a nestabilního antitoxinu, který účinek toxinu neutralizuje. Toxinové části jsou u perzisterů silně exprimované a v nadbytku nad antitoxiny mají zřejmě zásadní roli v navození tolerance k antibiotikům (MDT). Tato práce shrnuje příčiny vzniku perzisterů i jejich hypotetické strategie přežití, a zabývá se především TA systémy, kontrolujícími perzistenci modelového organismu Escherichia coli. Důraz je kladen na popis molekulárních mechanismů toxicity a její regulaci u TisB/IstR-1 TA systému typu I, HipBA, RelBE, MazEF, DinJ-YafQ, MqsRA TA systémů typu II a GhoST TA systému typu V. Klíčová slova: perzistence,...
|
|
|
Charakterizace Ms1, nově identifikované malé RNA z Mycobacterium smegmatis
Pospíšil, Jiří ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Úvod: V poslední době stále roste zájem o regulaci genové exprese pomocí malých nekódujících RNA (sRNA). Jako první sRNA byla v 60. letech objevena 6S RNA u E. coli (délka ~184 nt). Trvalo ovšem dalších ~ 30 let než byla pochopena její funkce. 6S RNA se váže během stacionární fáze na RNA polymerázu (RNAP), obsahující faktor σ70 (primární faktor sigma) a tím je zabráněno transkripci ze σ70 - dependentních promotorů. V naší laboratoři byla objevena malá RNA (délka ~300 nt) ve stacionární fázi Mycobacterium smegmatis. Tato sRNA byla následně pojmenována jako Ms 1. Funkce Ms 1 je prozatím neznámá a předchozí experimenty naznačují, že by se mohla vázat na RNAP, neobsahující faktor sigma A. Cíle: Cílem této diplomové práce je přispět k charakterizaci Ms 1. Přístupy: Jako první jsem pomocí klonování, afinitní chromatografie a transkripce in vitro připravil komponenty pro následující experimenty in vitro: RNAP, σA , Ms 1 a její mutované varianty. Dále byly tyto komponenty použity ve vazebných pokusech na nativním gelu a v transkripčních experimentech. Výsledky: Byly připraveny RNAP, σA , Ms 1 a její varianty. In vitro vazebné testy ukázaly, že se wt Ms 1 váže na RNAP, na rozdíl od některých mutovaných Ms 1. Byly tak identifikovány oblasti Ms 1, důležité pro vazbu. Následně byl sestaven aktivní transkripční...
|
|
|
Vliv exprese vanZTei a vanZg na rezistenci ke glykopeptidovým antibiotikům u Staphylococcus aureus
Zieglerová, Leona ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Membránový protein VanZTei, který je kódován genem vanZ z vanA glykopeptidového rezistenčního genového klastru je součástí velké rodiny VanZ proteinů. VanZTei udílí rezistenci k teikoplaninu u Enterococcus faecalis a to nezávisle na přítomnosti dalších proteinů kódovaných klastrem. Náplní práce bylo porovnat schopnost dvou ortologních proteinů VanZTei a VanZg (z genomické DNA Enterococcus faecium) udílet rezistenci ke glykopeptidům u Staphylococcus aureus RN4220 a u Enterococcus faecium. Bylo zjištěno, že VanZg 8-16 krát zvyšuje rezistenci k teikoplaninu (Tei) a udílí 8 krát větší rezistenci k dalbavancinu (Dalb). VanZTei také udílí rezistenci k Tei i Dalb, ale zvýšení rezistence je jen dvojnásobné. Naopak VanZTei udílí v porovnání s VanZg účinněji rezistenci k nově syntetizovaným glykopeptidovým antibiotikům (čtyřnásobné zvýšení rezistence pro VanZTei a 2-4 násobné zvýšení rezistence pro VanZg). To naznačuje, že oba proteiny mají rozdílnou specificitu k antibiotikům. Přesto byly vyselektovány mutanty S. aureus RN4220 VanZTei pRMC2 se zvýšenou rezistencí k teikoplaninu (MICTei > 8 µg/ml) u nichž je rezistence závislá na expresi vanZTei. Tyto rezistentní mutanty nenesou mutaci v genu vanZTei ani v jeho ribozomálním vazebném místě. Ani jeden z proteinů neudílí rezistenci k vankomycinu a k jiným...
|
|
|
Microbial consortia and metagenome of industrially polluted soil: occurrence of genes encoding AEH
Pitkina, Anastasiya ; Kyslík, Pavel (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Půda obsahuje různorodá společenstva bakterii, což z ní děla atraktivní cíl pro metagenomický výzkum a zkoumání kultivovatelných organizmů. Tato diplomová práce analyzuje složení mikrobiálního společenstva farmaceuticky znečištěných půd, s využitím sekvenační technologie nové generace Illumina a knihovny amplikonů 16S rDNA. Tato analýza odhalila vysokou komplexitu mikrobiálního prostředí půd a potvrdila to, že antropogenní aktivita (konkrétně produkce beta-laktamových antibiotik) ovlivňuje variabilitu a relativní zastoupení druhů, aniž by však snižovala mikrobiální diverzitu. V druhé části této diplomové práce je popsaná isolace a heterologní exprese nového genu kódujícího alfa-amino acid ester hydrolázu (AEH), který pochází z kultivovatelného půdního mikroorganizmu B. cereus. AEH mají velký průmyslový potenciál v biokatalytických syntézách beta-laktamových antibiotik, které jsou momentálně velmi důležité z hlediska uplatnění v medicíně. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Bakteriální REP elementy: původ, variabilita a využití.
Nunvář, Jaroslav ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Pačes, Jan (oponent) ; Melter, Oto (oponent)
6 ABSTRAKT (česky) Tato práce shrnuje tři publikace, jejichž jednotícím tématem jsou bakteriální REP (angl. repetitive extragenic palindrome) elementy. REP elementy jsou jednou z nejznámějších a nejlépe charakterizovaných skupin repetitivních DNA sekvencí u bakterií. Jsou známé především u gamaproteobakterií, včetně enterobakterií. Vyskytují se v nekódujících oblastech hostitelských genomů, zpravidla ve stovkách kopií. REP elementy jsou typicky agregovány do repetitivních útvarů vyšších řádů. U gramnegativní modelové bakterie Escherichia coli byly popsány interakce REP elementů s několika důležitými proteiny buněčné fyziologie, svědčící o významné roli těchto sekvencí pro hostitelskou buňku. První studie (Nunvar et al. 2010) prezentuje objev třídy proteinů příbuzných tyrosinovým transponázám ze skupiny IS200/IS605 inzerčních sekvencí. Tyto proteiny, pojmenované RAYT (angl. REP-associated tyrosine transposase), jsou charakteristické přítomností specifických motivů v jejich aminokyselinové sekvenci, nepřítomných u kanonických IS200/IS605 transponáz. Dalším společným znakem je uspořádání genů kódujících RAYT proteiny. Tyto geny se v hostitelském chromozomu vyskytují vždy v jedné kopii a jsou z obou stran ohraničeny alespoň dvěma REP elementy v inverzní orientaci. Na základě podobnosti mezi systémem...
|
|
|
Y1 a Y2 transponázy, mechanizmus transpozice, biologická funkce.
Zahradník, Jiří ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Transponázy jsou enzymy katalyzující štěpení, přenos a opětovné vložení mobilního genetického elementu do DNA. Tyrozinové transponázy zaujímají mezi těmito enzymy zcela unikátní postavení. Jejich výjimečnost je dána strukturou a odlišným mechanizmem transpoziční reakce, v kterém vždy figuruje kovalentní fosfotyrozinový intermediát. Nezbytná přítomnost katalytického tyrozinu dala těmto enzymům jméno a zároveň je umožňuje dále členit na skupinu nesoucí pouze jeden katalytický tyrozin - Y1 transponázy a na skupinu se dvěma - Y2 transponázy. Tato práce shrnuje současné poznatky o skupině tyrozinových transponáz. Zabývá se jejich výskytem, strukturou, reakčním mechanizmem a biologickou funkcí. Detailně je popsán reakční mechanizmus nejvíce prostudované Y1 transponázy asociované s IS608 elementem. Dále se práce zaměřuje na ostatní členy rodiny tyrozinových transponáz nesoucí charakteristický HUH motiv: Transponázy asociované s inzerčními sekvencemi rodiny IS200/IS605 (Y1), transponázy asociované s REP elementy (tzv. RAYT proteiny), transponázy asociované s IS91 (Y2), transponázy se společným regionem (ISCRs, Y1) a neobvyklé eukaryotní transponázy rodiny Helitron (Y2). Mezi tyrozinové transponázy patří dva jedinečné příklady domestikace těchto enzymů u prokaryot (RAYT, IStrony). Charakterizace mechanizmu...
|
|
|
Úloha malých efektorových molekul při signalizaci u bakterií.
Kolář, Petr ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Hilská, Markéta (oponent)
Malé efektorové molekuly plní důležitou úlohu ve fyziologii bakterií. Jsou rozděleny do několika podkategorií molekul, vyskytujících se v bakteriální buňce. Jednu z nich tvoří malé signální molekuly mechanizmu quorum sensing, které v rámci extracelulární signalizace umožňují mezibuněčnou komunikaci v bakteriálních populacích. Zprostředkují informaci o buněčné hustotě a různých vlastnostech vnějšího okolí. Další podkategorií malých efektorových molekul jsou modifikované nukleotidy. Účastní se intracelulárních signálních drah, které vedou k regulaci změn životních strategií bakteriálních populací, v závislosti na měnících se zevních podmínkách. Nejlépe prozkoumané jsou signalizační dráhy využívající molekuly c-di-GMP a (p)ppGpp. Podrobné studie byly provedeny u zástupců gram pozitivních (Bacillus subtilis) a gram negativních (Escherichia coli, Vibrio cholerae) bakterií, u kterých bylo také prokázáno propojení signálních drah zprostředkovaných c-di-GMP s mechanizmem quorum sensing (Vibrio cholerae, Xanthomonas campestris). Důležitý objev na poli malých efektorových molekul byla signalizace prostřednictvím c-di-AMP u bakterie Bacillus subtilis. Nové mechanizmy regulace byly rovněž prokázány u nejlépe prozkoumané malé efektorové molekuly cAMP, v kontextu propojení signálních drah (Vibrio cholerae)....
|
|
|
SCCmec a jiné mobilní genetické elementy spojené s rezistencí k meticilinu u stafylokoků.
Kubištová, Lucie ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Plocek, Vítězslav (oponent)
Stafylokoky jsou běžnou součástí lidské flóry, ale jsou také nebezpečnými patogeny. Mezi stafylokoky je velmi rozšířená rezistence k meticilinu. Za rezistenci k meticilinu je odpovědný gen mecA uspořádaný do mec komplexu, který je součástí mobilního genetického elementu - stafylokokové chromozomové kazety SCCmec. SCCmec je rozsáhlý variabilní mobilní genetický element, je vždy tvořen třemi částmi, kterými jsou mec komplex, ccr komplex a J oblasti. Komplex mec obsahuje gen mecA a jeho regulační geny mecR1 a mecI. Komplex ccr kóduje geny pro rekombinázy, které jsou odpovědné za vystřižení a vložení SCCmec kazety. J oblasti jsou zbývající části SCCmec kazet, které obsahují další mobilní genetické elementy, ty mají buď přímý vliv na expresi genů pro rezistence k meticilinu, nebo nesou geny pro rezistence k jiným antimikrobiálním látkám. Celá kazeta nebo její součásti se mohou rozšiřovat horizontálním přenosem genů mezi stafylokoky stejného druhu i mezidruhově, i když mechanizmus přenosu je stále nejasný. V současnosti je popsáno celkem jedenáct typů SCCmec kazet. V této práci jsem shrnula poznatky o molekulárním složení SCCmec, horizontálním přenosu genů odpovědných za rezistenci k meticilinu a molekulární evoluci SCCmec. Mobilní genetické elementy hrají klíčovou roli pro evoluci a adaptaci bakterií....
|
|
|
Charakterizace proteinu HelD z Bacillus subtilis
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
ÚVOD: Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) je intenzivně studovaný enzym, který je klíčový pro genovou expresi. V Laboratoři molekulární genetiky bakterií byl objeven nový protein, HelD, interagující s RNAP z bakterie Bacillus subtilis - tedy potenciální transkripční faktor. HelD je protein o velikosti cca 90 kDa, který je příbuzný s proteiny helikázové rodiny UvrD/Rep, rozplétajících DNA ve směru 3'-5'. Role proteinu HelD v buňce nicméně ještě není známá a rovněž nebyla dosud studována případná role HelD v transkripci. CÍLE: Cílem této diplomové práce bylo charakterizovat protein HelD. PŘÍSTUPY: Charakterizace HelD probíhala na třech úrovních: (i) bioinformatická analýza in silico byla použita k nalezení homologů proteinu HelD v jiných bakteriálních druzích; (ii) růstové testy in vivo byly použity pro nalezení fenotypu ΔHelD kmene v porovnání s divokým typem a (iii) biochemické experimenty in vitro byly použity k popsání efektu HelD na transkripci a k otestování, zda dokáže HelD vázat a rozplétat DNA. VÝSLEDKY: Bioinformatická analýza in silico ukázala, že protein HelD se vyskytuje u kmene Firmicutes G+ bakterií důležitých pro průmysl i medicínu. Fenotypové růstové testy odkryly, že HelD je protein důležitý pro rychlou adaptaci buňky na změny v prostředí. Biochemické experimenty ukázaly, že HelD...
|
host ::
RSS.