|
|
Pórotvorné vlastnosti toxinu CyaA bakterie Bordetella pertussis a složení membránové dvojvrstvy.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Bordetella pertussis produkuje mnoho virulenčních faktorů mezi které patří adenylát- cyklázový toxin (ACT, CyaA). Tento toxin preferenčně napadá buňky imunitního systému, které mají integrinový receptor CD11b/CD18, a způsobuje tak oslabení imunitního systému hostitele. Na napadené buňky působí CyaA dvěma způsoby: 1) CyaA vytváří v membráně napadené buňky kationt-selektivní póry a způsobuje tak koloidně osmotickou lýzi napadené buňky, 2) CyaA způsobuje konverzi cytosolického ATP na signální molekulu cAMP, což způsobuje ztrátu fyziologických funkcí napadené buňky a taktéž vede k buněčné smrti. Cílem mé práce bylo otestovat vhodnost nového modelového systému ze syntetických lipidů - difytanoylů, pro charakterizaci pórotvorných vlastností adenylát-cyklázového toxinu. V minulosti se k charakterizaci využíval modelový systém z azolektinu, který je složen z mnoha různých lipidů a je tak příliš komplexní pro zjišťování úlohy jednotlivých lipidů. Dále byl zjišťován vliv cholesterolu na aktivitu adenylát-cyklázového toxinu v tomto systému, protože bylo zjištěno, že k translokaci adenylát-cyklázové domény dochází v lipidových raftech, které jsou bohaté na cholesterol. Posledním cílem mé diplomové práce bylo charakterizovat mnou nově objevený typ kanálu s dvěma vodivostními stavy. Klíčová slova: Bordetella...
|
|
|
Úloha RTX domény v aktivitě adenylátcyklázového toxinu z Bordetella pertussis
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Adenylátcyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis je protein sestávající z 1706 aminokyselin, obsahující na svém N-konci enzymatickou adenylátcyklázovou (AC) doménu a na C-konci repetitivní RTX (z angl. Repeat-in-Toxin) doménu. Přítomnost RTX domény řadí CyaA do rodiny tzv. RTX proteinů, sekretovaných z cytosolu gramnegativních bakterií sekrečním aparátem typu I (T1SS). RTX doména CyaA se skládá z pěti bloků nonapeptidových RTX repetic s konsenzuální sekvencí X-(L/I/V)-X-G-G-X-G-X-D. Cílem této práce bylo určit úlohu RTX domény v biologické aktivitě CyaA a její vliv na sekreci toxinu z buněk Bordetella pertussis. Systematická deleční analýza bloků RTX repetic ukázala, že žádná z připravených delečních variant toxinu nebyla schopna translokovat AC doménu přes cytoplazmatickou membránu do cytosolu cílových buněk a tvořit póry v membránách těchto buněk. Odstranění jednotlivých bloků RTX repetic vedlo navíc k nízké efektivitě sekrece mutant do vnějšího prostředí bakterie. Z těchto dat vyplývá, že strukturní celistvost RTX domény CyaA hraje klíčovou úlohu nejen v cytotoxické aktivitě proteinu, ale napomáhá i při jeho sekreci přes T1SS.
|
|
|
Analýza membránových proteinů patogenní bakterie Francisella tularensis
Schmidt, Monika ; Szotáková, Barbora (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Katedra biochemických věd Kandidát Mgr. Monika Schmidt Školitel Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. Název disertační práce Analýza membránových proteinů patogenní bakterie Francisella tularensis Bakterie Francisella tularensis je vysoce nakažlivý fakultativně intracelulární patogen způsobující onemocnění tularemie. Dosud jediná vyvinutá vakcína proti tomuto patogenu nemá ve většině zemí licenci pro humánní použití z důvodu nedostatečné standardizace a účinku proti vysoce virulentním kmenům. Jedním z nedávno popsaných významných faktorů virulence bakterie F. tularensis je konzervovaný hypotetický lipoprotein s homologií k thiol/disulfidoxido-reduktázám (DsbA). Odstraněním genu pro tento protein dochází k oslabení bakterie a vývoji imunoprotekce. Sekvence proteinu DsbA obsahuje C-koncovou DsbA_Com_1-like doménu, zahrnující konzervované aktivní místo C-X-X-C a cis-prolinovou smyčku, a N- koncovou peptidyl-prolyl-izomerázovou doménu FKBP typu. V této práci jsme se zaměřili na funkční a substrátovou analýzu proteinu DsbA. Funkční analýza tohoto proteinu prokázala význam jak katalytického aktivního místa a cis-prolinu, tak celé FKBP_N domény pro disulfidoxidoreduktázovou aktivitu proteinu DsbA. Dále tato práce odhalila in vitro...
|
|
|
Simulace interakce steroidních allosterických modulátorů NMDA receptorů s membránou
Riedlová, Kamila ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Novák, Josef (oponent)
Metoda molekulové dynamiky (MD) umožňuje v reálném čase sledovat vývoj systému složeného z atomů a molekul. Takovým systémem může být např. lipidová dvojvrstva a biomolekula. MD simulace se nejčastěji uplatňuje v návrhu léčiv, kdy laboratorní experimenty s reálným objektem mohou být finančně a časově náročné nebo neproveditelné. Cílem této práce bylo objasnit využití a užitečnost metody MD aplikované na studium lipidových dvojvrstev a ukázat praktické využití této techniky, kterým je studium chování neurosteroidů v lipidových dvojvrstvách. Vhodně navržené a uměle syntetizované neurosteroidy by se mohly uplatnit v léčbě vážných neurologických onemocnění. Součástí této práce jsou i experimentální data získaná MD simulacemi pro vybrané neurosteroidy - pregnanolon glutamát a pregnanolon sulfát. Pomocí MD simulace bylo sledováno chování těchto molekul v modelových membránách a analyzováno. Klíčová slova: molekulově dynamická simulace, modelová membrána, lipidová dvojvrstva, NMDA receptor, neurosteroidy, pregnanolon glutamát, pregnanolon sulfát
|
|
|
Intracelulární život patogenní bakterie Francisella tularensis v hostiteli.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Francisella tularensis je fakultativně intracelulární patogenní bakterie, která způsobuje u hostitele onemocnění nazvané tularémie. Pro vstup do hostitelské buňky využívá Francisella hostitelské buněčné mechanismy, kterými je inkorporována do buněčného fagozomu. Z fagozomu následně uniká do cytosolu, kde probíhá bakteriální pomnožení. Některé pomnožené bakterie jsou odstraňovány autofagií, z jiných se uvolňuje dsDNA, která je rozeznána cytosolickými senzory, které vytvoří inflamazomový komplex. Inflamazom spouští dráhu vedoucí k smrti napadené buňky. Francisella již od průniku do buňky ovlivňuje buněčnou signalizaci ve svůj prospěch tak, aby si zajistila dostatečný čas a dostatek potřebných živin pro své pomnožení. Francisella nepůsobí jen v napadené buňce, kde omezuje své rozeznání a odstranění z cytosolu, ale také indukuje sekreci faktorů z buňky, které utlumí aktivaci adaptivní imunity hostitele. Klíčová slova: Francisella, tularémie, fagozom, inflamazom, autofagie, adaptivní imunita
|
|
|
Vývoj a validace metod pro detekci GMO
Hodek, Jan ; Ovesná, Jaroslava (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent) ; Pazlarová, Jarmila (oponent)
V předkládané práci je řešena problematika stanovení geneticky modifikovaných organismů (GMO) v rostlinách a odvozených produktech. Platná legislativa v Evropské unii nařizuje sledování GMO a upravuje pravidla pro jejich značení a dohledatelnost. Cílem práce bylo přispět k řešení vybrané problematiky kritických bodů stanovení GMO. Prvním bodem byla extrakce DNA. Problematika byla řešena pro případ extrakce DNA z plodů papáji a z kandované papáji. Pro obě potraviny byla vhodnost vybrané metody extrakce ověřena a potvrzena amplifikací specifického úseku extrahované DNA metodou PCR. Dalším bodem byla real-time PCR, kdy byla řešena problematika inhibitorů reakce. Byla ukázána inhibice real-time PCR vlivem EDTA a vlivem zbytkového množství iontů těžkých kovů, obsažených v laboratorním plastu. V obou případech vedla inhibice k ovlivnění efektivity reakce. Další kritickou částí stanovení GMO je používání screeningových elementů. Práce byla zaměřena na falešnou pozitivitu výsledků. Dalším cílem práce byl vývoj nových metod pro stanovení GMO. Byla představena metoda real-time PCR pro kvantifikaci taxon-specifického genu hrachu setého. Metoda byla ověřena na 13 kultivarech hrachu setého a vybraných příbuzných rostlinách čeledi bobovitých. Použití metody vysoce účinné kapalinové chromatografie s hmotnostním...
|
|
|
Ekologie hub, asociovaných s tlejícím dřevem v ekosystémech přirozených lesů
Zrůstová, Petra ; Baldrian, Petr (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Tlející dřevo hraje důležitou roli v lesním ekosystému z hlediska koloběhu uhlíku a živin, regenerace lesa a uchování biodiverzity. Poskytuje prostorové niky a potravní zdroje značnému množství hub, bakterií, bezobratlých a dalším organismům. Ligninocelulóza dřeva představuje velmi odolný a obtížně rozložitelný materiál, jehož dekompozice se účastní hlavně vláknité houby. Složení houbového společenstva se mění v průběhu dekompozice, ale vztah mezi kvalitativními vlastnostmi substrátu a společenstvem dekompozitorů není zdaleka objasněn. Tato práce je zaměřena na komplexní popis houbového společenstva tlejícího dřeva vzhledem k druhu stromu, stádiu rozkladu, objemu a fyzikálně-chemickým vlastnostem dřeva jako je pH, obsah uhlíku a dusíku. Pro charakterizaci houbového společenstva byly použity sekvenační metody nové generace - 454- pyrosekvenování a sekvenování na platformě Illumina MiSeq. Druh stromu, objem dřeva (větve, kmeny) a délka tlení byly hlavními proměnnými vysvětlujícími rozdíly ve složení společenstev. Počáteční kolonizace houbami byla rychlejší u větví nežli u kmenů - svědčily o tom vyšší hodnoty enzymových aktivit a vyšší obsah houbové biomasy. Se změnou společenstva hub v průběhu dekompozice se měnily i fyzikálně-chemické vlastnosti dřeva a hodnoty enzymových aktivit. Se stoupajícím...
|
|
|
Morfogeneze bakteriálních kolonií
Čepl, Jaroslav ; Markoš, Anton (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent) ; Nemec, Alexandr (oponent)
Tato disertace svým tématem navazuje na předchozí práce naší skupiny, zejména Rieger et al. 2008 a Čepl et al. 2010. Popisovali a zkoumali jsme pravidelnosti morfogeneze kolonií S. marcescens morfotypu F (od "fontána", kterou nám kolonie svým tvarem připomínaly). Kolonii tvoří červený vystouplý střed, nízké nepigmentované mezikruží a znovu vystouplý červený lem, jehož vytvořením kolonie ukončuje svůj růst. Jasně strukturovaný profil kolonie tohoto morfotypu, společně se změnami pigmentace struktur v průběhu vývoje, bez nutnosti umělé vizualizace, poskytuje pro pozorování morfogeneze značnou výhodu. Naším cílem se postupně stalo (i) najít další faktory, které ovlivňují tuto morfogenezi a pokusit se blíže popsat; (ii) druhým cílem byla charakterizace interakcí kolonií S. marcescens s jinými bakteriálními kmeny (S. rubidaea a E. coli) a konečně (iii) studovat fenomén indukované resistence k antibiotikům popsaný v (Heal and Parsons 2002; Lu 2004; Bernier et al. 2011) u našich modelových organismů. (i) Vzájemné vztahy kolonií na misce ukazují, že morfogeneze kolonie je ovlivněna autokinními signály, které difundují do media a do atmosféry a ovlivňují vývoj i okolních kolonií. Během vývoje kolonie jsme také pozorovali změny pH media v jejím okolí -...
|
|
|
Mechanismus sekrece adenylát cyklázového toxinu Bordetella pertussis pomocí sekrečního aparátu typu I (TISS)
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Sekreční aparát typu I gramnegativních bakterií umožňuje transport proteinů z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes vnitřní i vnější membránu v jednom kroku. Transmembránový kanál je složen pouze ze tří proteinů - ATPázy ve vnitřní membráně, fúzního proteinu a specifického proteinu ve vnější membráně. Tato práce podává přehled současných znalostí o struktuře tohoto sekrečního aparátu, formování komplexu v membráně a o mechanismu sekrece proteinu. Zdůrazněna je role sbalování proteinu na sekreci. Dále je nastíněna charakteristika substrátů sekrečního aparátu typu I, se zaměřením na adenylátcyklázový toxin bakterie Bordetella pertusis, původce černého kašle.
|
|
|
Konformační změny proteinových membránových senzorů
Sklenářová, Petra ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Fraiberk, Martin (oponent)
Tato práce je zaměřena na stavbu a funkci prokaryotických signálních systémů. V bakteriích se nacházejí tři typy signálních systémů: jednokomponentové, dvoukomponentové a tříkomponentové systémy. Tyto tři systémy se od sebe liší zejména stavbou a počtem proteinů a domén, které jsou jejich součástí. Zabývala jsem se zejména dvoukomponentovými systémy u bakterií, i když byl jejich výskyt potvrzen i u nižších eukaryot. Prokaryotické dvoukomponentové systémy jsou hlavními prostředky, kterými bakterie rozpoznávají různé podněty z prostředí a reagují na ně. U bakterií jsou dosud popsány dva typy dvoukomponentových systémů. Prvním je základní systém a druhým systém složený. Oba typy dvoukomponentových systémů obsahují dva nepostradatelné proteiny: histidin kinázu a odpovídající regulátor. Liší se však doménovou stavbou proteinů a mechanizmem přenosu signálu. U základního systému přenos probíhá ve dvou krocích, u složeného celkem ve čtyřech krocích. Vždy je však princip stejný, jde o přenesení fosfátové skupiny z histidin kinázy na odpovídající regulátor, který je tímto signálem aktivován a může regulovat transkripci DNA.
|
host ::
RSS.