|
|
Eucaryotic cells systems and their biotechnologycal applications
Porubiaková, Otília ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Vorlíčková, Michaela (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The submitted dissertation is divided into several parts. The first part deals with the interactions of the p53 protein and its isoforms with different potential DNA substrates under different experimental conditions. These are predominantly DNA and its non-canonical structural motifs, such as G-quadruplexes or cruciform structures, whose interactions have been studied in yeast isogenic systems or by in vitro methods. The seconds part deals with the bioinformatic analysis of the mentioned secondary DNA structures in different organismal groups, and the result is a set of publications that show their non-random distribution in the genome and their relationship with regulation. The last part of the work contains unpublished results, including the results of testing the effect of natural and synthetic substances on aging in model human cells.
|
|
|
Analýza lokalizace inverzních repetic v bakteriálních genomech
Šedý, Michal ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Inverzní repetice (IR) jsou přirozenou součástí DNA všech známých prokaryotických i eukaryotických organismů. Inverzní repetice mají důležitou roli při regulaci základních buněčných procesů. Jsou zodpovědné za vznik křížových struktur. Inverzní repetice taktéž zapříčiňují genomovou nestabilitu a mohou být zdrojem řady mutací. Křížové struktury mohou být rozeznávány celou řadou DNA vazebných proteinů a také mohou fungovat jako transkripční regulátory. Pomocí nástroje Palindrom analyser byla analyzována frekvence výskytu a lokalizace inverzních repetic v bakteriálních genomech. Frekvence výskytu inverzních repetic napříč bakteriálními genomy vykazuje variabilní charakter. Frekvence výskytu krátkých inverzní repetic vykazuje přibližně kvadratickou závislost na % obsahu GC párů v genomu s minimem okolo 50 % obsahu GC. Lokalizace inverzních repetic vzhledem k funkčním oblastem DNA vykazuje nenáhodný charakter rozložení. Frekvence výskytu IR u většiny sledovaných funkčních oblastí je vyšší „vně“ než „uvnitř“.
|
|
|
Analýza lokálních struktur v molekulách DNA
Nyczová, Adéla ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Lokální struktury DNA jsou alternativními konformacemi, které dokáže DNA zaujímat oproti nejběžnější konformaci B-DNA. Tyto struktury hrají často zásadní roli v regulaci základních biologických procesů, jako je replikace DNA, transkripce či vazba specifických ligandů. Díky tomuto biologickému významu jsou alternativní sekundární struktury DNA potenciálním cílem řady léčiv. V této diplomové práci jsou pomocí bioinformatických nástrojů analyzovány lokální struktury v genomech virů z čeledí Flaviviridae a Retroviridae a následně jsou tyto struktury zobrazeny pomocí atomové silové mikroskopie.
|
|
|
Vliv teploty a sucha na obsah proteinů gliadinové frakce u dvou odrůd pšenice
Seidlová, Kateřina ; Brázda, Václav (oponent) ; Hrstka, Miroslav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vlivem teploty a sucha na obsah proteinů gliadinové frakce u dvou odrůd pšenice. Vybranými odrůdami byly Hyfi a Julie kultivované při teplotách 26, 29, 32, 35 a 38 °C v podmínkách, kde bylo kontrolováno zavlažování. Pro vzorky kultivované za vlhka měla půda vlhkost větší než 70 %, za sucha měla půda vlhkost nižší než 30 %. Po sklizni byla zrna rozemleta na mouku, ze které byly gliadiny extrahovány 2-chlorethanolem. Pro separaci gliadinů byla použita metoda A PAGE, kvantifikace byla provedena počítačovou denzitometrií. Byl zjištěn výrazný vliv genotypu na lepkové proteiny. Zatímco u odrůdy Hyfi při současném působení sucha neměla teplota v rozmezí 26–38 C výrazný vliv na obsah gliadinů, u odrůdy Julie vykazoval obsah gliadinů zřetelné maximum při 32 °C. Odrůda Hyfi se tedy vyznačovala větší odolností vůči teplotnímu stresu než odrůda Julie. U obou odrůd byl obsah gliadinů vyšší za sucha než při zavlažování.
|
|
|
Sekvence tvořící G-kvadruplexy v lidském genu a jeho homolozích pro amyloid beta prekursor
Stránská, Anna ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
APP gen kóduje transmembránový protein amyloid beta prekursor, který je exprimován v mnoha typech buněk, včetně neuronů. Jeho funkce nebyly zatím zcela popsány, je ale zřejmé, že u něj probíhá štěpení před exportem do extracelulárního prostoru. Dochází k jeho degradaci po různých rozkladných drahách a homodimerizaci, při které mohou vzniknout částice s protektivní funkcí neuronů stejně tak jako fragmenty, které jsou toxické a způsobují smrt nervových buněk. Vznik škodlivých amyloidních beta plaků a jejich hromadění mezi neurony v mozku je úzce spjato se vznikem a postupem Alzheimerovy choroby, neurodegenerativního onemocnění mozku projevujícího se smrtí a ztrátou neuronů, která vede k nástupu demence, tedy ztráty kognitivních funkcí. V současné době existuje mnoho výzkumů, které se zabývají souvislostmi mezi neurodegenerativními onemocněními a výskytem G-kvadruplexů v genech, které jsou zapojeny do projevů nemocí. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární struktury nukleových kyselin DNA a RNA, které vznikají v oblastech bohatých na guanin. Jsou významné především z hlediska jejich spojitosti s biologickými procesy jako je regulace genové exprese v genech a převážně v onkogenech, protože se vyskytují ve významných oblastech genu jako je promotor. Je možné je stabilizovat malými molekulami, a právě této schopnosti je využíváno ve výzkumu terapeutické léčby různých onemocnění. Ke zjištění důležitosti vyplývající z lokalizace a konzervovanosti G-kvadruplexů vyskytujících se v lidském APP genu, byla provedena bioinformatická analýza jak genu člověka, tak 346 dalších genových homologů. Pro tento účel byl použit program G4Hunter, který poskytl informace o nalezených sekvencích s potenciálem tvořit G-kvadruplex, jako je jejich umístění či G4Hunter skóre. Dále byla provedena in vitro analýza pomocí činidla thioflavin T, která otestovala schopnost nalezených sekvencí tvořit G-kvadruplexy za fyziologických podmínek. Výsledky potvrdily přítomnost a evoluční důležitost G-kvadruplexů nalezených v APP genu Homo sapiens a jejich schopnost skládat se v přítomnosti solí jako je sodík a draslík do kvadruplexních struktur.
|
|
|
Analýza změn genomu C. necator po evoluční adaptaci
Kroupa, Štěpán ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá analýzou mutačních změn bakteriálních populací Cupriavidus necator H16 po evoluci za různých stresových podmínek. Tato analýza byla provedena zpracováním dat z metody sekvenování genomu „Next Generation Sequencing“, která byla provedena externí společností DNALink. Na základě bioinformatického postupu byl sestaven seznam mutačních změn pro každou adaptovanou populaci. Dále byly stanovené mutační změny asociovány s konkrétními oblastmi referenčního genomu Cupriavidus necator H16 z NCBI a analyzovány dle dostupných informací. Na závěr byl diskutován případný vliv stanovených mutací na produkci zásobních polymerů polyhydroxyalkanoátů.
|
|
|
Použití vysokorozlišovací analýzy křivek tání ke studiu baktérií mléčného kvašení
Knápková, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V současné době roste zájem o užívání probiotických výrobků a na trhu je jich celá řada. S rostoucím zájmem je kladen i větší důraz na identifikaci deklarovaných probiotických mikroorganismů. Přesná identifikace mikrobiálního složení je často nelehkým úkolem a je zapotřebí pokročilejších metod, zejména z oblasti molekulární diagnostiky. Diplomová práce byla zaměřena na ověření přítomnosti deklarovaných probiotických mikroorganismů v probiotických doplňcích stravy GS Laktobacily Forte 21, Biopron 9 Premium a Linex® Forte. DNA byla z komplexních matric izolována fenolovou extrakcí, komerčním kitem a magnetickými nosiči F79/L3-PLL v kvalitě vhodné pro PCR. Následně byla izolovaná DNA amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s využitím rodově a druhově specifických primerů. Specifický PCR produkt byl podroben agarózové gelové elektroforéze, přičemž druhová identifikace nebyla vždy v souladu s údaji deklarovanými výrobci. Další část práce se zabývala polymerázovou řetězovou reakcí s vysokorozlišovací analýzou křivek tání za účelem rozlišení bakteriálních kmenů patřících do skupiny Lactobacillus a za účelem identifikace probiotických mikroorganismů přítomných ve směsi v probiotických doplňcích stravy. Bylo testováno osm sad primerů (V1F HRM a V1R-HRM, CHAU-V3F a CHAU-V3R, CHAU-V6F a CHAU-V6R, LAC2 a LAC4, LAC1 a LAC2, P1V1 a P2V1, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT). Jako nejvhodnější pro rozlišení bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus byly vyhodnoceny tři dvojice primerů (V1F HRM a V1R-HRM, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT).
|
|
|
Využití různých metod izolace DNA baktérií mléčného kvašení v molekulárně biologických metodách
Chvalkovská, Eva ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Předkládaná práce se zabývá probiotickými bakteriemi, izolací DNA z těchto baterií třemi různými metodami a vlivu izolace na identifikaci DNA pomocí molekulárně biologických metod. Probiotické bakterie jsou důležitou součástí trávícího traktu člověka. Mají důležitou roli pro funkci imunitního systému, a to díky adhezi na sliznici trávícího traktu, kde vytváří nehostinné prostředí pro patogeny. Probiotické baterie přijímáme běžně v potravě, ať už v mléčných výrobních nebo pomocí doplňků stravy. Díky nadužívání antibiotik ovšem hrozí riziko předání vnitřní rezistence, kterou probiotické bakterie mají kvůli udržení přirozené homeostáze trávícího traktu, patogenním bakteriím. Je tedy důležité efektivně identifikovat rizikové probiotické bakterie, které mají schopnost rezistenci přenášet a eliminovat tak jejich přítomnost v potravinách a potravinových doplňcích. V experimentální části byly zkoumány tři metody izolace DNA, metoda fenolové extrakce, izolace magnetickými částicemi a izolace komerčním kitem. DNA byla izolovaná ze tří doplňků stravy a to Biopron 9 premium, Linex forte a GS Laktobacily forte 21. Čistota a koncentrace izolované DNA byla zjištěna spektrofotometricky. Přítomnost jednotlivých kmenů DNA v potravinových doplňcích byla potvrzena metodou polymerázové řetězové reakce v reálném čase. Jako nejlepší metoda izolace, co se týče čistoty a koncentrace izolované DNA byla na základě RT–PCR a spektrofotometrie vyhodnocena metoda izolace komerčním kitem.
|
|
|
Use of some molecular techniques to metabolic characterization of industrially significant yeasts
Kostovová, Iveta ; Brázda, Václav (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Carotenoids, ergosterol and fatty acids are valuable compounds used in food, feed and cosmetic industries. Since their conventional sources depend on weather conditions, season, geographical location, and availability of agricultural land, it is necessary to increase its availability for constantly increasing demand. Microbial production of aforementioned compounds exploiting carotenogenic yeast is promising due to their extraordinary capability to simultaneously produce carotenoids, ergosterol and fatty acids. Hereby Doctoral Thesis was aimed to provide the molecular and metabolic characterisation of various carotenogenic yeasts and their potential for industrial applications. For this purpose, the first experimental parts are focused in great detail on yeast species R. mucilaginosa and R. toruloides, their production properties and the influence of nutritional stress and different carbon sources, such as xylose and glycerol. Besides the detailed characterization of their production properties, were these strains also characterized by molecular methods, including sequence analysis of ITS1, ITS2 and D1/2 of the ribosomal operon and analysis of mini and microsatellite sequences M13 and GTG5. R. toruloides is known as an excellent producer of fatty acids and because of it, it recently became a target carotenogenic yeast for the development of tools for its genetic manipulation. In this work were successfully prepared genetically modified clones of R.toruloides bearing over-expressed genes for DGA1 (diacylglycerol acyltransferase) and GPD1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase). Their production of fatty acids was not higher in comparison to the original strain. Therefore, the next part was focused on the preparation of overproducing mutant strains prepared by random mutagenesis. The combination of nitrogen limitation and the carotenoid production inhibitor diphenylamine led to the successful selection of carotenoid overproducing robust mutant strains with resistance to diphenylamine. The last part of the thesis deals with the production properties of lesser known carotenogenic yeast species among order Sporidiobolales and Cystofilobasidales in comparison to relatively well studied carotenogeic yeast species represented by R. toruloides and P. rhodozyma. The best fatty acid-producing strains were S. metaroseus CCY19-6-20 and C. macerans CCY 10-01-02. Moreover, the best carotenoid producer, R.mucilaginosa CCY 19-04-06, naturally produced lycopene in amounts representing more than 80 % of total carotenoids.
|
|
|
Vliv přírodních látek z čaje na G-quadruplexy a vazebné a transaktivační vlastnosti proteinu p53
Foltanová, Klára ; Řeháková, Veronika (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Nádorový supresorový protein p53 patří mezi nejdůležitější regulátory buněčného cyklu při poškození DNA. Kromě zástavy buněčného cyklu a navození apoptózy, interaguje protein p53 s jinými proteiny a DNA. Mutace genu TP53 kódující protein p53 jsou společným znakem lidské rakoviny. Tato bakalářská práce zkoumá přírodní látky z čaje, které by mohly hrát pozitivní roli v aktivaci proteinu p53 u nádorových onemocnění a uplatnit se v podpoře léčby těchto onemocnění. V teoretické části bakalářské práce byly popsány sekundární struktury DNA, konkrétně struktura a vlastnosti G-kvadruplexů, dále protein p53 a jeho vazebná aktivita k sekundárním strukturám DNA. Byly popsány vybrané přírodní látky vyskytující se v čajích a potravinách – kyselina gallová a apigenin. Cílem experimentální části této práce bylo ověřit schopnost těchto látek interagovat s G-kvadruplexy in vitro a tím je stabilizovat v kvasinkovém modelu a posoudit následný vliv na intenzitu účinku transkativace proteinu p53. Interakce kvartérních struktur s G4 ligandy byla ověřena in vitro pomocí ThT fluorescenčního testu a luciferázového reportérového testu. Bylo zjištěno, že G4 ligandy o koncentraci 30 M po 20 hodinách inkubace nevykazovaly výraznější vliv na testované kvasinkové kultury. Při koncentraci G4 ligandů 60 M bylo pozorováno navýšení produkce proteinu p53, vlivem buněčného stresu způsobeného přítomností G4 ligandů.
|
host ::
RSS.