|
Studies of the Mouse polyomavirus: properties of the minor structural proteins, requirements for virion productive trafficking to the nucleus and observed side effects of DNA transfection.
Huérfano- Meneses, Sandra ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Mělková, Zora (oponent) ; Reiniš, Milan (oponent)
V této práci jsme zkoumali roli minoritních strukturních proteinů VP2 a VP3 Myšího polyomaviru (MPyV) v replikačním cyklu viru a také specifické aspekty pohybu internalizovaných virionů MPyV buňkou směrem k buněčnému jádru. Disertační práce je rozdělena do tří kapitol. První kapitola řeší otázky interakce VP2 a VP3 se strukturami hostitelských buněk a také roli těchto proteinů v pozdních stádiích virové infekce. Druhá kapitola se zabývá rolí pozdních endozómů, recyklujících endozómů a aktinového cytoskeletu v produktivním transportu MPyV. Kapitola tři obsahuje výsledky studia interferonové (IFN) odpovědi indukované nukleofekcí DNA do buněk. Této poslední studii předcházela analýza putativních změn hladin transkripce buněčných genů (microarray analysis) vyvolaných transientní produkcí VP2 nebo VP3. V první kapitole jsme ukázali, že oba minoritní strukturní proteiny, pokud jsou produkovány v buňkách samostatně (bez VP1) jsou velmi cytotoxické a indukují rychlou, na kaspázách závislou apoptózu. Imunoelektronová a konfokální mikroskopie odhalila afinitu obou proteinů k endobuněčným membránám. VP2 i VP3 byly detegovány na poničených membránách endoplasmatického retikula (ER) a mitochondrií. Interakce minoritních proteinů s membránami, působící poškození organel jako ER a mitochondrie, je zjevně příčinou...
|
|
Elucidating the interactions of interleukin-1alpha with components of the eukaryotic transcription machinery
Zámostná, Blanka ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
5 ABSTRAKT Interleukin-1α (IL-1α) je pleiotropní cytokin, který hraje klíčovou roli v imunitní odpovědi organismu. Je produkován jako prekursor o molekulové hmotnosti 31 kDa, který je štěpen cysteinovou proteázou calpainem za vzniku maturovaného IL-1α (17 kDa) a tzv. N-terminálního peptidu IL-1α (IL-1αNTP; 16 kDa). Ačkoliv IL-1α může být sekretován a spouštět dráhu signální transdukce skrze povrchové receptory cílových buněk, bylo zjištěno, že IL-1α se účastní také některých procesů v buněčném jádře. IL-1αNTP je u vyšších eukaryot vysoce konzervován a obsahuje jaderný lokalizační signál, díky kterému prekursor i samotný IL-1αNTP vstupují do buněčného jádra. Při předchozím výzkumu byla popsána genetická interakce IL-1α s jadernými histonacetyltransferázovými (HAT) komplexy v savčích buňkách a překvapivě také v heterologním kvasinkovém modelu. Tato disertační práce se dále věnuje výzkumu jaderné funkce IL-1α a přináší důkazy o fyzické interakci IL-1α s "HAT/Core" modulem kvasinkových histonacetyltransferáz SAGA a ADA. Výsledky pokusů zahrnujících knock-out jednotlivých podjednotek kvasinkových HAT komplexů a následné koimunoprecipitace poukazují na nový model skládání SAGA komplexu, ve kterém ADA představuje pravděpodobně jen částečně aktivní HAT komplex. V savčích buňkách jakožto přirozeném modelu pro...
|
|
Host-virus interactions of mammalian endogenous retroviruses
Farkašová, Helena ; Elleder, Daniel (vedoucí práce) ; Hirsch, Ivan (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
Endogenní retroviry (ERV) vznikají retrovirovou infekcí zárodečné linie a následným přenosem do dalších generací podle pravidel Mendelovy dědičnosti. Až na pár výjimek jsou všechny druhy savčích ERV evolučně staré a fixované v populaci svých hostitelských druhů. O některých skupinách retrovirů se předpokládálo, že nejsou schopny vytvářet endogenní kopie. Objevili jsme další příklad endogenního Lentiviru a první endogenní Deltaretrovirus. Obě tyto skupiny byly dříve považovány za neschopny vytvářet endogenní kopie. Endogenní lentiviry byly objeveny pouze nedávno a stale se považují za velmi vzácné. Toto jsou stále jen minoritní důkazy z kterých nemůžeme získat celkový obraz o průběhu virové endogenizace. Popsali jsme nový endogenní Lentivirus v genomu letuchy malajské (Galeopterus variegatus) a nazvali ho ELVgv (endogenous Lentivirus of G. variegatus). Na základě několika analýz jsme dokázali, že se jedná o nejstarší dosud objevený Lentivirus, a potvrdili jsme jeho přítomnost v jediném jiném současném druhu Dermopter - Cynocephalus volans. Endogenní deltaretroviry byly poslední retrovirovou skupinou bez nalezeného endogenního člena. Našli jsme zbytky endogenního Deltaretroviru v genomu netopýra létavce natalského (Miniopterus natalensis). Tato retrovirová sekvence byla přítomna v genomu pouze v jedné kopii....
|
|
Mechanismy kontroly endogenních retrovirů v hostitelské buňce.
Matoušková, Magda ; Hejnar, Jiří (vedoucí práce) ; Mělková, Zora (oponent) ; Pačes, Jan (oponent)
Ve své práci se zabývám lidskými endogenními retroviry (HERV), které se účastní vývoje placenty a prasečími endogenními retroviry (PERV) v souvislosti s nebezpečím jejich přenosu na člověka při transplantaci prasečích orgánů. Ukázali jsme, že methylace DNA je důležitý umlčující mechanismus regulující expresi HERV i PERV. (1) V placentě je demethylace dvou HERV, ERVWE1 a ERVFRDE1, nezbytná pro její správný vývoj, zatímco ve varlatech je spojená se vznikem seminomů. (2) Methylace PERV je zřejmě zodpovědná za jejich nízkou expresi v tkáních, čímž značně snižuje nebezpečí zoonotického přenosu při xenotransplantacích. (3) Určité riziko však zůstává, protože na rozdíl od myších a potkaních buněk jsou lidské buňky in vitro vysoce permisivní vůči PERV, a to především díky funkčnímu receptoru a neschopnosti umlčet integrovaný PERV.
|
|
Typ buněčné smrti a blok superinfekce v buňkách infikovaných virem vakcinie
Lišková, Jana ; Mělková, Zora (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent) ; Němečková, Šárka (oponent)
Virus vakcinie (VACV) byl v minulosti využíván v eradikační kampani proti černým neštovicím. Infekce VACV je ve většině buněčných typů, včetně epiteliálních, lytická, což odpovídá nekrotické buněčné smrti. Při infekci epiteliálních linií HeLa G a BSC-40 VACV kmenem Western Reserve (WR) však byla v naší laboratoři již dříve pozorována aktivace kaspáz, která je typická pro apoptózu. V této práci byl blíže studován typ buněčné smrti buněk HeLa G a BSC-40 infikovaných VACV a také byla charakterizována aktivace a aktivita kaspáz u těchto infikovaných buněk. U buněk HeLa G infikovaných VACV kmene WR byla identifikována apoptóza na základě kondenzace jader, aktivity kaspázy 3 a štěpení substrátů smrti. V infikovaných buňkách HeLa G byla také detekována aktivace i aktivita kaspáz 2 a 4. U buněk BSC-40 infikovaných VACV kmenem WR apoptóza ani aktivita kaspáz pozorována nebyla, aktivace kaspáz 2 a 4 však zde byla detekována také. V infikovaných buňkách obou buněčných linií byla také štěpena prokaspáza 3 a 12. Vakcinační kmeny Dryvax a Praha indukovaly apoptózu v buňkách HeLa G i BSC-40, což bylo prokázáno apoptotickou morfologií jader a také detekcí štěpení substrátu exekutorových kaspáz PARP. Naše výsledky naznačují, že typ buněčné smrti infikovaných buněk může souviset s virulencí a imunogenitou různých...
|
|
Mechanizmus inhibičního účinku kyseliny ethakrynové na růst viru vakcínie
Váchová, Barbora ; Mělková, Zora (vedoucí práce) ; Španielová, Hana (oponent)
Virus vakcínie (VACV) je celosvětově znám pro své využití v eradikační kampani proti viru varioly (VARV), původci pravých neštovic. Roku 1980 prohlásila WHO VARV za vymýcený a tímto rokem tak ukončila celoplošné očkování. Vzhledem k obavám ze zneužití varioly pro bioteroristické účely začaly některé země po roce 2001 opět očkovat vybrané skupiny obyvatelstva. Nově proto vyvstala otázka léčby nejen pravých neštovic, ale také postvakcinačních komplikací a následků přenosu VACV na běžnou populaci. V roce 2009 popsala laboratoř Dr. Mělkové inhibiční účinek kyseliny ethakrynové (EA) na růst VACV na úrovni exprese pozdních genů. Cílem mojí diplomové práce bylo provést detailnější studii účinku EA na pozdní proteosyntézu a na některé další fáze replikačního cyklu VACV. Ke splnění zadaného úkolu byly použity tyto metody: infekce tkáňových kultur, plaková zkouška, northern blot, slot blot, western blot, přímá i nepřímá imunofluorescence fixovaných buněk a fluorescence EGFP exprimovaného VACV v živých infikovaných buňkách. Prvním úkolem bylo zjistit, zda EA ovlivňuje transkripci, či translaci pozdních genů VACV. Naše výsledky ukazují, že EA nesnižuje hladinu pozdních mRNA VACV a pravděpodobně tedy účinkuje na úrovni jejich translace. Dále jsme se zabývaly studiem efektu EA na fáze následující po expresi...
|
|
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Horníková, Lenka ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1,...
|
|
Patogeneze eczema vaccinatum
Elsterová, Jana ; Mělková, Zora (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent)
Virus vakcínie (VACV) je znám především jako vakcína proti jemu příbuznému viru variola, který je původcem černých neštovic. Tímto očkováním byly černé neštovice v 70. letech 20. století eradikovány a následně bylo očkování proti této chorobě zastaveno. V současnosti se v některých zemích opět začalo s očkováním, a to u vybraných armádních zaměstnanců a u zdravotníků. Očkování VACV však ve vysokém procentu způsobuje komplikace, zejména u imunokompromitovaných jedinců. Jednou z komplikací je i eczema vaccinatum, které se může rozvinout u lidi trpících atopickou dermatitidou. Laboratoř MUDr. Zory Mělkové, Ph.D. se dlouhodobě zabývá vývojem modelu eczema vaccinatum na myších Nc/Nga a studiem patogeneze této komplikace. Cílem mé diplomové práce je přispět k charakterizaci imunopatogeneze eczema vaccinatum u myší Nc/Nga infikovaných VACV kmene Western Reverse (WR) a rekombinantním virem vakcínie WR-IRF3 s integrovanou cDNA pro transkripční faktor IRF-3 (Interferon Regulatory Factor 3). IRF-3 reguluje expresi interferonů typu I v odpověď na virovou infekci a tento rekombinant byl v minulosti zkonstruován v laboratoři MUDr. Zory Mělkové, Ph.D. Mým cílem bylo ověřit expresi integrované cDNA pro IRF-3 a charakterizovat růst tohoto rekombinantního viru. Z výsledků získaných pomocí RT-PCR pro vybrané cytokiny (IL-1,...
|
|
Molecular mechanisms of apoptosis regulation by fatty acids in pancreatic β-cells
Němcová, Vlasta ; Kovář, Jan (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
Incidence diabetu 2. typu velmi rychle narůstá a představuje velkou hrozbu pro zdravotnictví i ekonomiku 21. století. Diabetes 2. typu je jasně asociován s obezitou a dysfunkce a apoptóza pankreatických β buněk v důsledku zvýšené hladiny mastných kyselin v krvi je považována za důležitý faktor přispívající k rozvoji tohoto onemocnění. Molekulární mechanismy zodpovědné za neblahé účinky mastných kyselin však nejsou dostatečne známy. Cílem tohoto výzkumného projektu bylo přispět k objasnění mechanismů, kterými nasycené a nenasycené mastné kyseliny regulují viabilitu a indukci apoptózy u lidských pankretických β buněk in vitro. U lidské β-buněčné linie NES2Y jsme ukázali, že zvýšené hladiny nasycených mastných kyselin přijímaných potravou (kyselina palmitová a stearová) indukují apoptózu pankreatických β buněk, narozdíl od příslušných nenasycených mastných kyselin (např. kyselina palmitolejová a olejová). Zjistili jsme, že apoptóza indukovaná kyselinou stearovou je doprovázena signifikantní aktivací kaspázy 2, 6, 7, 8 a 9, ale ne signifikantní aktivací kaspázy 3. Nebyla však spojena s vyléváním cytochromu c, změnou exprese proteinů PIDD, Fas a FasL a s aktivací proteinu p53. Působení kyseliny stearové vedlo k rychlé aktivaci signálních drah stresu endoplazmatického retikula (ER) (tj. IRE1α, PERK a...
|
|
Charakter of the host cell iduced by vaccinia virus and inhibitory effects of the lipoic acid on vaccinia virus growth
Spišáková, Martina ; Mělková, Zora (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Pospíšek, Martin (oponent)
Vírus vakcínie je typickým zástupcom poxvírusov. V minulosti bol ako vakcína používaný na úspešnú eradikáciu pravých kiahní (ang. smallpox). V súčasnosti je používaný ako vektor pre profylaktické aj experimentálne účely. Táto dizertačná práca nadväzuje na výsledky publikovaných prác z nášho laboratória a je zčasti zameraná na bližšie charakterizovanie vplyvu infekcie vírusom vakcínie na typ bunkovej smrti hostiteľskej bunky. Výsledky ukazujú na to, že počas infekcie vírusom vakcínie sa aktivujú dráhy apoptózy, apoptóza ale nie je dokončená a bunka umiera nekroticky. V našich pokusoch sme farmakologickou inhibíciou aktivity enzýmu PARP (Poly-(ADP-ribóza) polymeráza) nedokázali zmeniť formu bunkovej smrti indukovanú vírusom vakcínie z nekrózy na apoptózu. Efekty anti-apoptotických faktorov kódovaných vírusom vakcínie pravdepodobne hrajú významnejšiu úlohu. Ďalšia časť práce sa venuje sledovaniu inhibičného efektu redox-modulujúcej látky, kyseliny lipoovej, na infekciu vírusom vakcínie. Výsledky ukázali jej inhibičný vplyv v bunkových líniach rôzneho embryonálneho pôvodu. Naše výsledky ukazujú na to, že inhibičný efekt kyseliny lipoovej je na úrovni expresie neskorých génov alebo morfogenézy vírusových častíc. Kyselina lipoová tak ponúka možnosť použitia ako podpornej látky pri liečbe infekcie poxvírusmi.
|