|
|
Indukce oxidačního stresu u buněk kožních keratinocytů
Martínková, Nikola ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Hradiská Breiterová, Kateřina (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Studentka: Nikola Martínková Vedoucí práce: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Konzultant: Mgr. Petr Jošt, Ph.D. Název diplomové práce: Indukce oxidačního stresu u buněk kožních keratinocytů Keratinocyty jsou součástí epidermis a představují majoritní část buněk svrchní vrstvy lidské kůže. Při poškození těchto buněk mutagenními látkami mohou nastat změny ve složení genetického materiálu, popřípadě může dojít i k zániku buňky. Mezi látky, které navozují změny v DNA a mají mutagenní potenciál lze zařadit i zpuchýřující bojovou chemickou látku sirný yperit. Cílem této práce bylo porovnat buněčnou linii keratinocytů HaCaT s experimentálně odvozenou buněčnou linií 3HSM4 v odpovědi na oxidační stres indukovaný peroxidem vodíku. Buňky 3HSM4 byly připraveny selekcí rezistentních klonů buněk HaCaT, které byly opakovaně vystaveny cytotoxickým účinkům sirného yperitu. Výsledky porovnání ukazují, že buňky 3HSM4 jsou rezistentnější vůči peroxidu vodíku. Pokud byla u obou typů buněk blokována syntéza glutathionu (GSH), byl cytotoxický účinek peroxidu vodíku stejný. Přesto, že se buňky 3HSM4 ukázaly jako odolnější z pohledu cytotoxicity, byla u nich zjištěna mnohem vyšší hladina volných radikálů než u buněk HaCaT. Při analýze...
|
|
|
Vliv oxidativního stresu na strukturu a funkci cytoplasmatické membrány spermie v rámci oplození
Tojnerová, Kateřina ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Šanovec, Ondřej (oponent)
Oxidační stres je způsoben nerovnováhou mezi antioxidanty a oxidanty, a tedy následným přebytkem reaktivních forem kyslíku (ROS). Muže být také způsoben nedostatečnou antioxidační ochranou, která za normálních okolností snižuje hladiny ROS a chrání tak buňku před poškozením. Oxidační stres způsobuje změny ve struktuře a funkci cytoplazmatické membrány spermie během procesu oplození. Má zde pozitivní vliv na fyziologické funkce, kdy nízké hladiny ROS jsou nutné k správnému vývoji spermie jako je například kapacitace či hyperaktivace spermie. Nicméně ve vyšších hladinách ROS působí patofyziologicky, snižuje fluiditu membrány vlivem peroxidace lipidů membrány, může dojít také k fragmentaci DNA, ztrátě motility a následné neschopnosti spermie oplození. Klíčová slova: oxidativní stres, cytoplazmatická membrána, spermie, oplození
|
|
|
Posouzení subchronické toxicity směsí pesticidů na raky
HOVORKOVÁ, Anna
Prometryn, řadící se do skupiny s-triazinů, byl značně využíván v případě ochrany produkce kukuřice před širokolistými plevely a travinami. Jeho používání bylo zakázáno EU v roce 2004. Chloridazon je pyridazonový herbicid využívaný pro ochranu produkce řepy a k hubení širokolistých plevelů. Jeho vlastnosti zvyšují potenciál přenosu tohoto pesticidu do vodního prostředí. Společně se svými metabolity je detekován v podzemních vodách na území ČR. Zákaz jeho používání v ČR je od roku 2020. Příhodné vlastnosti a dlouhodobé využívání těchto látek mohou zvyšovat riziko kontaminace necílových ekosystémů používanými pesticidy a jejich metabolity, které v tomto prostředí mohou vytvářet směsi a mít tak ještě rizikovější dopad na životní prostředí. Cílem této práce bylo posouzení subchronické toxicity vytvořené směsi pesticidů z koncentrací zmíněných pesticidů na raku signálním (Pacifastacus leniusculus) v porovnání s kontrolou a pesticidy testovanými samostatně. K získání výsledků byl využit subchronický test toxicity v délce trvání 20 dnů s následnou 10denní depurací. Kritéria hodnotící toxicitu směsi byly biochemický profil hemolymfy, míra oxidačního stresu a aktivita antioxidačních enzymů ze vzorků hepatopankreatu, svalu a žaber. Biochemický profil hemolymfy byl významněji ovlivněn u jedinců testovaných ve směsi pesticidů. U biomarkerů pozměněných v důsledku směsi bylo v některých případech pozorováno potlačení vlivu prometrynu ve směsi. Analýza antioxidačních biomarkerů neprokázala vyšší toxicitu směsi nad pesticidy testovanými samostatně. V případě antioxidantů byl větší vliv pozorován u prometrynu testovaného samostatně, kdy v některých případech jeho přítomnost ve směsi potlačila účinek chloridazonu v této směsi.
|
|
|
Vliv elektrochemicky generovaného peroxidu vodíku na stresovou odpověď mikroorganismů za účelem zvýšené produkce PHA
Najbrtová, Johana ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Ehlich, Jiří (vedoucí práce)
Předmětem předložené diplomové práce je vliv elektrochemicky tvořeného peroxidu vodíku na produkci polyhydroxyalkanoátů. Peroxid vodíku byl v této práci generován přímo v kultivačním médiu s bakteriemi, a to dvouelektronovou redukcí kyslíku. Tato práce je dělena na teoretickou část, která se věnuje přiblížení tématiky polyhydroxyalkanoátů, oxidativního stresu, elektrochemické produkce H2O2 a propojení elektrochemie s biotechnologií. Experimentální část je zaměřena na aplikaci těchto poznatků. Peroxid vodíku byl generován aplikací elektrického potenciálu na elektrodový systém složený konkrétně z nerezové ocelové pracovní elektrody, titanové protielektrody a pseudoreferenční Ag/AgCl elektrody vložených do polypropylenového držáku. Po počáteční elektrochemické charakterizaci připraveného systému byl vybrán potenciál -0,8 V a -1 V pro aplikaci v kultivačních experimentech. Zde byl zkoumán vliv H2O2 na stresovou odpověď bakterie Cupriavidus necator H16 z České sbírky mikroorganismů. Z výsledků kultivačních experimentů bylo patrné, že elektrochemicky produkovaný H2O2 nemá výrazný vliv na vývoj bakteriální kultury. Avšak samotný elektrodový systém pozitivně ovlivňuje bakteriální růst. Vliv H2O2 nebyl patrný z důvodu nízké produkce v médiu. Ta byla způsobena nízkou koncentrací kyslíku v objemu kultivačního média. V průběhu práce byl navrhnut nový elektrodový systém s vyšší tvorbou H2O2, který mohl využívat vzdušného kyslíku pro redukci na H2O2. Avšak ani s tímto systémem nebylo dosaženo chtěné stresové odpovědi bakterie, jelikož zvýšené tvorbě H2O2 bránil biofilm vzniklý na elektrodách. Dále bylo v práci zjištěno, že materiály použité na elektrodový systém podporují tvorbu biofilmu, a to hlavně titan, nerezová ocelová mřížka a polypropylen.
|
|
|
Tukové emulze v dlouhodobé parenterální výživě
Ševela, Stanislav ; Novák, František (vedoucí práce) ; Cahová, Monika (oponent) ; Lahoda Brodská, Helena (oponent)
Kombinace intestinálního selhání a parenterální výživy je stavem spojeným s mírným chronickým zánětem a orgánovým poškozením, z nichž nejvýznamnější je poškození jaterní. Tato zkřížená intervenční studie zkoumala účinky různých intravenózních lipidových emulzí (IVLE) obohacených o zvýšené dávky omega-3 polynenasycených mastných kyselin (n-3 PUFA) z rybího oleje (RO) u pacientů na domácí parenterální výživě (DPVP) pro chronické intestinální selhání. Dvanácti pacientům byly postupně podávány tři různé IVLE, po každé z nich ještě přidána emulze RO. Studie rovněž zahrnovala dvanáct párovaných zdravých kontrol ke srovnání. Cílem této studie bylo zjistit, jak dlouhodobé podávání těchto IVLE ovlivnilo primárně spektrum mastných kyselin (MK) v erytrocytech a plazmě, dále pak zánětlivou odpověď, antioxidační stav, markery jaterních funkcí a spektrum žlučových kyselin u DPVP a jak se tyto změny lišily od zdravých osob. Prokázali jsme úspěšnou inkorporaci n-3 PUFA do erytrocytárních fosfolipidů a odpovídající změny spektra plazmatických MK, charakterizované zejména signifikantní nárůsty n-3 vůči n-6 PUFA, s poklesem poměru n-6/n-3 PUFA. Zjistili jsme také dlouhodobější ovlivnění těchto změn při vysoké dávce podávaného RO. Konstatujeme zvýšené koncentrace cytokinů v séru a in vitro lipopolysacharidem (LPS)...
|
|
|
Využití separačních technik ve spojení s hmotnostní spektrometrií pro stanovení environmentálně významných látek
Mácová, Daniela ; Čelechovská, Olga (oponent) ; Márová, Ivana (oponent) ; Demnerová, Kateřina (oponent) ; Čáslavský, Josef (vedoucí práce)
Prvním tématem předkládané dizertační práce byla identifikace degradačních produktů flexibilních polyurethanových pěn s přidaným biodegradovatelným plnidlem vzniklých hydrolýzou a fotodegradací. U hydrolyzátů polyurethanových pěn, určených pro ekotoxikologické testy, byly za pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (HPLC/MS) separovány hydrolýzní degradační produkty. Jejich struktura byla objasňována pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie (MSn). Fotodegradační produkty polyurethanových pěn byly získány expozicí materiálů záření vlnové délky 254 nm. Semivolatilní degradační produkty byly z materiálu izolovány extrakcí n-hexanem, volatilní sloučeniny mikroextrakcí tuhou fází (SPME). Pro jejich identifikaci byla použita plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC/MS) a orthogonální kompletní tandemová plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GCxGC/TOF MS). V závěru této části je diskutován vliv přidaného bioplnidla na charakter degradačních produktů a vliv stanovených degradačních produktů na životní prostředí. Předmětem druhého tématu bylo stanovení izoprostanů – markerů oxidativního stresu v tkáních mořského bezobratlovce sasanky koňské (Actinia equina). Z kyseliny arachidonové byly syntetizovány F2-izoprostany, které byly použity pro vývoj a optimalizaci metody stanovení těchto látek pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC/MS/MS). Optimalizována byla izolace izoprostanů z tkání Actinia equina pomocí extrakce tuhou fází (SPE). Výsledná metodika byla použita pro kvantifikaci izoprostanů v tkáních Actinia equina, které byly vystaveny mírným i vysokým teplotním změnám. Změna teploty měla za cíl iniciovat v organismech oxidativní stres. Sledovány byly rovněž časové změny hladin neznámých sloučenin, které byly z tkání extrahovány spolu s F2-izoprostany. Identita těchto sloučenin je v dizertační práci rovněž diskutována. Závěrem práce je zhodnocení možnosti využití stanovení izoprostanů v korálnatcích k monitoringu oxidativního stresu těchto organismů.
|
|
|
Aplikace vybraných metod k analýze oxidačního stresu
Lízalová, Martina ; Tremlová, Bohuslava (oponent) ; Beklová, Miroslava (oponent) ; Vávrová, Milada (oponent) ; Lojek, Antonín (vedoucí práce)
Chronická pankreatitida (CHP) je progresivní onemocnění charakteristické chronickým zánětem pankreatické tkáně, který má různou etiologii. Oxidační stres, který je provázen zánětlivými procesy, se jeví jako velmi významný faktor přispívající k rozvoji chronické pankreatitidy. Cílem této práce bylo stanovit hladiny produktů lipidové peroxidace malondialdehydu (MDA) a 4-hydroxynonenalu (4-HNE), společně s nitrity, antioxidační kapacitou, pro- a protizánětlivými cytokiny, biochemickými a hematologickými parametry v plazmě pacientů s chronickou pankreatitidou a v plazmě kontrolních jedinců. Plazmatické hladiny MDA a 4-HNE byly stanoveny vysoceúčinnou kapalinovou chromatografií. Celková antioxidační kapacita plazmy vůči peroxylovému radikálu byla stanovena chemiluminiscenční metodou. Nitrity byly stanoveny za použití Griessovy reakce. Zánětlivé cytokiny - TNF-alfa; TNF RI; PDGF-AB; TGF-beta, společně s myeloperoxidázou a hyaluronanem byly stanoveny za použití ELISA metody. V plné krvi byly pak stanoveny také biochemické a hematologické parametry standardními metodami.
|
|
|
Využití stresových faktorů k produkci lipidických látek kvasinkami rodu Metschnikowia
Tručková, Marie ; Márová, Ivana (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
stresových faktorů v kultivačním procesu, jako je osmotický stres, oxidační stres, dehydratace, doba kultivace, pH či teplota, na kvasinky rodu Metschnikowia. Praktická část se fokusuje na stres osmotický a oxidační, přičemž oxidační stres byl proveden za dvou odlišných podmínek (odlišná doba kultivace a teplota). Produkční vlastnosti kvasinek byly monitorovány zejména plynovou chromatografií a okrajově také průtokovou cytometrií. Analýza byla provedena pro kmeny Metschnikowia pulcherrima, Metschnikowia andauensis, Metschnikowia chrysoperlae, Metschnikowia sinensis, Metschnikowia zizyphicola a Metschnikowia shanxiensis. Výsledky prokázaly, že jak oxidační stres, tak osmotický stres vyvolává lepší produkci lipidických látek. Množství lipidů a zejména složení mastných kyselin se také měnilo v závislosti na studovaných kmenech a použitých kultivačních podmínkách. V práci byla dále prokázána produkce nenasycených mastných kyselin. Nejvhodnějším prostředím pro produkci lipidů a nenasycených mastných kyselin se zde ukazuje být solné prostředí. Je možné s přehledem říci, že kvasinky rodu Metschnikowia jsou vysoce adaptabilními kvasinkami. Tato vlastnost z nich činí potenciálně slibné biotechnologické producenty.
|
|
|
Využití hmotnostní spektrometrie ke stanovení markerů oxidativního stresu a mykotoxinů
Čumová, Martina ; Večeřa, Zbyněk (oponent) ; Hajšlová, Jana (oponent) ; Vávrová, Milada (oponent) ; Čáslavský, Josef (vedoucí práce)
Prvním tématem předkládané dizertační práce bylo stanovení isoprostanů – markerů oxidativního stresu a dalších látek, které mohou být přítomností oxidativního stresu ovlivňovány. Sledování isoprostanů iPF2-III, iPF2-VI, iPF2-VI, astaxanthinu a polynenasycených mastných kyselin (PUFA), zejména pak kyseliny arachidonové (AA) probíhalo v jikrách lososa obecného (Salmo salar). Byly vyvinuty a optimalizovány metody stanovení těchto látek pomocí chromatografických metod ve spojení s konvenční nebo hmotnostně spektrometrickou detekcí. Výsledné metodiky byly použity pro kvantifikaci sledovaných analytů v jikrách Salmo salar, lišících se svojí životaschopností a vývojovým stadiem. V nepřeživších jikrách bylo obsaženo větší množství sledovaných isoprostanů a kyseliny arachidonové a zároveň nižší množství astaxanthinu než v kontrolních vzorcích jiker (reprezentujících nezatížené jedince). Také relativní zastoupení PUFA bylo ve vzorcích nepřeživších jiker vyšší než v kontrolních vzorcích. Čerstvě nakladené jikry obsahovaly srovnatelnou hladinu sledovaných isoprostanů s kontrolními vzorky. Pouze isoprostan iPF2 IV byl obsažen v kontrolních vzorcích pod limitem stanovitelnosti, zatímco čerstvě nakladené jikry obsahovaly nízké, avšak kvantifikovatelné množství. Vyšší hladiny PUFA a kyseliny arachidonové ve srovnání s kontrolou byly pozorovány u čerstvě nakladených jiker. Nicméně statisticky významný byl pouze rozdíl v množství astaxanthinu. Rozdílná hladina PUFA a astaxanthinu v jikrách mohla souviset s jejich biochemickou spotřebou během vývoje. Životaschopnost jiker Salmo salar proto mohla být ovlivněna přítomností oxidativního stresu. Druhá část této práce se zabývá sledováním mykotoxinů v potravinách a krmivech. Mykotoxiny jsou sekundární metabolity produkované plísněni. Jsou to všudypřítomné nežádoucí přírodní kontaminanty, které mohou vážně poškodit zdraví lidí a zvířat. V současné době je známo více než 500 druhů mykotoxinů. Evropskou legislativou je však regulováno pouze velmi malé množství z nich. Evropská komise však žádá Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) o data vedoucí k zavedení regulačních limitů pro další mykotoxiny. V této studii byla vyvinuta multireziduální metoda pro stanovení 17 mykotoxinů v biotických materiálech. Metoda zahrnuje jak mykotoxiny regulované EU, tak i další mykotoxiny v souladu s požadavky EFSA (aatoxiny, deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, fumonisiny, ochratoxin A, T-2 toxin, HT-2 toxin, enniatiny a beauvericin). Analyty jsou z matrice izolovány pomocí modifikované metody QuEChERS a analyzovány s použitím ultraúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (UPLC-MS/MS). Metoda navíc umožňuje ze stejného extraktu stanovit i ergotové alkaloidy (ergokornin, ergosin, ergokryptin, ergokristin a jejich odpovídající epimery). Vyvinutá metoda byla použita pro monitoring mykotoxinů a ergotových alkaloidů v krmivech a surovinách pro jejich výrobu a v pivovarském ječmeni a sladu z něj připraveném.
|
|
|
Influence of oxidative pressure on bacterial cells
Dugová, Hana ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with the impact of oxidative pressure on the bacterial strain Cupriavidus necator in its two forms: Cupriavidus necator H16 producing PHB granules and Cupriavidus necator PHB-4 as a mutant that is not capable of producing granules. The thesis compares different influences causing oxidative stress that is demonstrated by the occurrence of ROS in the cell. Furthermore, the cells were analysed with a flow cytometer and a fluorescence microscope. During the analysis it was necessary to use different types of fluorescence probes. The oxidative stress was created by means of hydrogen peroxide at various concentrations. Further tests focused on Fenton’s reaction including ammonium iron sulfate and cobalt chloride hexahydrate. Propidium iodide as a fluorescence probe was used to determine the viability of the bacterial cells, and BODIPY was tested as a lipophilic dye. Finally, the ROS in the cell was detected by H2DCFDA and CM–H2DCFDA, fluorescence probes that had to be optimised for the respective technique. The result of this bachelor thesis is the confirmation of the hypothesis that PHA granules production increase the resistance of Cupriavidus necator against oxidative stress.
|
host ::
RSS.