|
Studium mechanismu posttranskripčního a transkripčního umlčování transgenů v buněčné linii tabáku BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
RNA interference je jedním z mechanismů, který umožňuje buňkám regulovat aktivitu genů, ovlivňovat tvorbu a udržování heterochromatinu a chránit je před invazivními nukleovými kyselinami. U rostlin je RNA interference spouštěna přítomností dvoušroubovicové RNA, která je štěpena proteinem Dicer na malé RNA o délce převážně 20-24nt. Tyto malé RNA mohou v komplexu s proteinem Argonaut na základě sekvenční komplementarity řídit štěpení mRNA, blokování translace, či modifikace chromatinu. V důsledku tak může být genová exprese umlčována buď posttranskripčně (tím že je bráněno vzniku proteinu z již vytvořené mRNA, PTGS) a nebo transkripčně (tím že je bráněno vzniku transkriptu, TGS). Záměrem této práce bylo připravení různých způsobů spouštění posttranskripčního umlčování a porovnání jejich funkčnosti a účinnosti. Dalším krokem pak byla příprava systému, který by měl umožnit sledování jednotlivých kroků přechodu posttranskripčního umlčování na umlčování transkripční. Tyto tzv. indikátorové linie by měly dovolit sledovat časování a dynamiku tohoto procesu s využitím fluorescenčních proteinů. Připravovaný systém umožní také vyhodnocení různých faktorů na průběh tohoto procesu - jedním z nich je RNA-dependentní RNA polymeráza 6, která hraje hlavní roli v samovolném spouštění PTGS. V práci je použita jako modelový...
|
|
Studium a podjednotky lidského translačního iniciačního faktoru 3 (eIF3) metodou RNA interference.
Peclinovská, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Iniciace translace je klíčovým krokem proteosyntézy, který umožňuje regulaci genové exprese. Regulace na úrovni přepisu mRNA je nejrychlejším možným mechanismem. Celý proces je ovlivňován mnoha iniciačními faktory. Jedním z eukaryotických iniciačních faktorů, který participuje na celé řadě procesů během iniciace translace je eIF3. Za jeho velice efektivní, a pro iniciaci translace nezbytnou, alespoň v kvasinkách, byla označena největší podjednotka p170, též nazývaná eIF3a. Tato práce si klade za cíl, utvořit komplexní náhled na eIF3a, přičemž hodlá vycházet z poznatků nabytých sledováním této podjednotky v Saccharomyces cerevisiae. Snížení exprese eIF3a, které umožňuje pozorovat vliv této podjednotky pomocí různých experimentů v porovnání s kontrolní skupinou, je "navozeno" metodou RNA interference. Na eIF3a je zde nahlíženo z pohledu i) životaschopnosti buněk metodou využívající 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl- -tetrazolium bromid (MTT testu) ; ii) sleduje se vliv podjednotky na celkovou expresi proteinu inkorporací 35 S-methioninu a iii) v neposlední ředě je v této práci ukázán vliv snížené exprese eIF3a na tvorbu polysomů.
|
| |
|
Substrate cleavage by mammalian Dicer isoforms
Kubíková, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
Hostitelské organismy vyvinuly řadu antivirových odpovědí, které rozpoznávají a potlačují virovou infekci. Jedním ze znaků virové infekce je i přítomnost dvouvláknové RNA v buňce. Jedna z drah odpovídajících na dvouvláknovou RNA je RNA interference, která představuje klíčovou složku antivirové obrany u bezobratlých živočichů a rostlin. Savci využívají pro obranu před viry odlišnou dráhu, která rozpoznává dvouvláknovou RNA, nazývající se interferonová odpověd. RNA interference funguje jen v savčích oocytech a raných embryonálních stádiích, ačkoliv potřebné enzymové vybavení se nachází ve všech somatických buňkách, protože je využíváno mikroRNA dráhou. Předchozí studie ukázala, že funkčnost RNA interference v myších oocytech souvisí s přítomností oocytární isoformy Diceru (DicerO ), jež je zkrácená na N-konci. V této práci jsem se zaměřila na zhodnocení, zda DicerO zpracovává substráty typické pro RNA interferenci účinněji než nezkrácená isoforma Diceru (DicerS ), která se nachází v somatických buňkách. Za tímto účelem jsem vyvinula protokol na purifikaci Diceru, abych získala obě myší isoformy Diceru o vysoké čistotě. Následně jsem otestovala jejich aktivitu v neradioaktivní enzymové analýze na různých substrátech se strukturními prvky charakteristickými pro substráty RNA interference. Získané výsledky...
|
|
Vývoj leishmanií podrodu Viannia v přenašeči
Hlaváčová, Jana ; Volf, Petr (vedoucí práce) ; Dostálová, Anna (oponent)
Leishmanie podrodu Viannia jsou parazitičtí prvoci přenášení flebotomy (Diptera: Phlebotominae). Vyskytují se v tropických a subtropických oblastech Jižní Ameriky, kde způsobují kutánní a mukokutánní leishmaniózy. Naše práce se zabývala vývojem zástupců podrodu Viannia v trávicím traktu přenašeče a faktory, které jejich vývoj ovlivňují. V první části jsme zkoumali, jakým způsobem se vyvíjí Leishmania (Viannia) braziliensis v trávicím traktu Lutzomyia longipalpis. Pomocí GFP značeného kmene jsme potvrdili, že se jedná o peripylární typ vývoje. Po úniku z endoperitrofického prostoru promastigoti nejprve kolonizovali zadní střevo a poté migrovali anteriorně. Ve střevě se vyskytovaly 4 morfologické formy: dlouhé nektomonády, krátké nektomonády, metacykličtí promastigoti a paramastigoti. Pomocí histologických metod jsme demonstrovali přichycení leishmanií v pyloru, zatímco v mesenteronu byli přítomní pouze volní promastigoti. Přichycení promastigotů k epitelu mesenteronu, které je běžné u podrodu Leishmania, u L. braziliensis nebylo pozorováno. Další část práce byla věnována vlivu teploty na zástupce podrodu Viannia v přenašeči. Sledovali jsme vývoj dvou blízce příbuzných druhů L. peruviana a L. braziliensis ve střevě Lu. longipalpis při 20 řC a 26 řC. Leishmania braziliensis se vyvíjela dobře za obou...
|
|
Dynamika a mechanismus umlčování reportérového genu pro GFP v závislosti na aktivitě RDR6 a způsobu indukce RNA interference v buněčné linii tabáku BY-2
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent)
RNA interference (RNAi) je proces, který se u rostlin prostřednictvím malých RNA (sRNA = small RNA) významně podílí na regulaci genové exprese. Rozmanité dráhy RNAi lze rozdělit na dva základní mechanismy, a to posttranskripční a transkripční umlčování (PTGS a TGS). Vznik sRNA je vždy závislý na přítomnosti dvouvláknové molekuly RNA (dsRNA), která je štěpena některým z DCL proteinů za vzniku sRNA obvykle o délce 21 - 24 nt a jedno z vláken sRNA je následně rozpoznáno proteinem AGO. V případě PTGS interaguje komplex AGO- sRNA na základě komplementarity sekvence sRNA s cílovou RNA, kterou rozštěpí nebo zablokuje její translaci. U TGS reaguje AGO s rostlinně specifickou RNA Pol V a jejími transkripty, se kterými opět páruje vlákno sRNA nesené proteinem AGO. Tato interakce umožní sestavení komplexu proteinů, které indukují metylaci DNA a posléze i histonů, jež působí inhibičně na transkripci RNA Pol II. Způsobů, jakými může dsRNA vznikat, je celá řada. Velká část v buňce tvořených dsRNA je závislá na syntéze komplementárního vlákna do podoby dsRNA prostřednictvím RDR6 (RNA dependentní RNA polymeráza 6), která je zapojena i do procesu vzniku sekundárních sRNA. Význam RDR6 při PTGS byl zkoumán pomocí reportérového genu pro GFP, a to při samovolném umlčování a při umlčování vyvolaném třemi odlišnými...
|
|
Dynamics and variability of induced transgene silencing in tobacco cell line BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Pečinka, Aleš (oponent) ; Lafon Placette, Clément (oponent)
RNA interference (RNAi) je důležitým mechanismem regulace genové exprese u rostlin. RNAi u rostlin je spouštěna přítomností dvouvláknové RNA (dsRNA), která je následně zpracována na malé RNA (sRNA) o délce 21-24 nt. Malé RNA po navázání na protein Argonaut (AGO) jsou schopné rozeznat cílovou molekulu na základě sekvenční komplementarity. Pokud je cílem mRNA, může ji AGO rozštěpit, nebo může blokovat translaci, což vede k posttranskripčnímu umlčení (PTGS). Pokud je cílem DNA, tak může navodit její metylaci, což vede k transkripčnímu umlčení (TGS), pokud dojde k metylaci v promotoru. Jednotlivé komponenty RNAi jsou celkem dobře popsány, ale méně je známo o vlivu odlišných typů dsRNA prekursorů na dynamiku RNAi. Ke studiu těchto aspektů RNAi jsme využili tabákovou buněčnou linii BY-2 s reportérovým genem pro GFP cíleným silencery s inducibilní expresí. Fungování silencerů bylo založeno na třech základních způsobech tvorby dsRNA: transkripcí antisense GFP (AS), GFP bez terminátoru (UT) a GFP v invertované repetici (IR). Tyto tři silencery spouštěly PTGS, čtvrtý silencer byla IR cílící na CaMV 35S promotor a spouštějící TGS. To nám umožnilo studovat RNAi od její iniciace, přes plné umlčení až po obnovení exprese při vysazení induktoru - vše relativně snadno analyzovatelné díky vysoce homogennímu...
|
|
MikroRNA kódované polyomaviry.
Zachovalová, Veronika ; Bruštíková, Kateřina (vedoucí práce) ; Malík, Radek (oponent)
MicroRNA jsou malé regulační molekuly RNA kódované v genomu organismu. Biogeneze mikroRNA probíhá částečně v jádře a částečně v cytoplazmě. Výsledkem je funkční, 22 nt dlouhá molekula mikroRNA. MikroRNA jsou schopné umlčovat geny za pomoci sekvenčně specifické degradace cílové mRNA, nebo za pomoci represe translace cílových, komplementárních mRNA. U savců je běžnější mechanismus represe translace, kdy je mikroRNA neúplně komplementární k 3'UTR cílové mRNA. Polyomaviry jsou malé, neobalené DNA viry s cirkulárním dsDNA genomem a ikosahedrální kapsidou tvořenou pentamerami VP1 proteinu. Tyto viry se řadí mezi tzv. onkogenní viry, neboť mohou přispět k transformaci buněk a rozvoji vážných onemocnění jako je například karcinom Merkelových buněk. Ve svém genomu kódují regulační proteiny nazývané T antigeny, strukturní geny kapsidy, ale také mikroRNA. Právě na mikroRNA kódované genomem SV40, MPyV, MCPyV, BKPyV a JCPyV bude zaměřená tato práce. Klíčová slova: polyomaviry, malé interferující RNA, mikroRNA, siRNA, RNA interference, myší polyomavirus, BK virus, JC virus, SV40
|
|
Study of RNAi mechanisms in tobacco BY-2 cell line and potato plants
Tyč, Dimitrij ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kovařík, Aleš (oponent) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Znalosti o procesech RNA interference, tedy regulace genové exprese prostřednictvím malých RNA (sRNA), se za posledních 30 let nebývale rozrostly. Některá zjištění byla doslova revoluční, neboť odhalila děje, které převrátily mnohé dosud zažité představy. Řada jevů se ukázala být značně konzervovaná a společná různým druhům organismů, jiné jsou však specifické pro určité vývojové větve či dosud ne zcela prozkoumané. Chybí také znalost o propojení četných drah - kupříkladu mezi umlčováním na transkripční (TGS, vedoucí k metylaci promotoru) a posttranskripční úrovni (PTGS, ovlivňující stabilitu mRNA či translaci). Předkládaná práce shrnuje poznatky dvou publikovaných a dvou dosud nepublikovaných prací a pokouší se prostřednictvím různých rostlinných modelových organismů popsat některá z méně známých míst RNA interference. Výzkum na transgenních liniích Solanum tuberosum odhalil možnost obnovit pomocí 5- azacytidinu expresi transkripčně umlčených transgenů na úrovni celých rostlin. Regenerace de novo z listů takovýchto rostlin může vést k opětovnému umlčení reaktivovaných transgenů a sloužit tak jako selekční metoda pro vyřazení linií náchylných k samovolnému umlčení. Charakter změn v expresi dvou sledovaných reportérových genů naznačoval spřažení PTGS a TGS, ale také, možnost postupného šíření...
|
|
Biocompatible protein cages for encapsulation and internatization of small interfering RNA
Mokrý, Michal ; Balvan, Jan (oponent) ; Heger, Zbyněk (vedoucí práce)
This thesis is focused on creation of apoferritin nanocarrier with encapsulated small interfering RNA marked with fluorescent dye. Main objectives are optimization of pH and amount of siRNA encapsulated into apoferritin cavity and physicochemical characteristics of created nanocarrier. First part deals with theoretical knowledge necessary for understanding concept of this thesis. Second part describes used methods and evaluated results. Created apoferritin nanocarriers were optimal in size with great hemocompatibility, but long-term stability didn’t meet our expectations.
|