|
|
Formation of splicing machinery in the context of the cell nucleus
Stejskalová, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent) ; Malínský, Jan (oponent)
Většina genů kódujících proteiny vyšších eukaryot obsahuje introny, které musí být odstraněny z primárních transkriptů. Vznikající mRNA může být poté použita jako templát pro syntézu proteinů. Sestřih intronů probíhá za pomoci složitého sestřihového komplexu, který se skládá z malých jaderných ribonukleoproteinových částic. Tyto částice vznikají během několika postupných kroků, které se odehrávají jak v jádře, tak v cytoplazmě. Sestřihový komplex se poté postupně skládá na molekule pre- mRNA. Jedná se o velmi dynamický a přesně regulovaný proces, který závisí nejen na sekvenci samotné pre-mRNA, ale záleží i na stavu celého jádra, např. na modifikacích chromatinu. Mezi základní nezodpovězené biologické otázky patří například: Jak buňky řídí, kdy a kde se sestřihový komplex poskládá? Co předurčuje, které introny budou vystřiženy? V této práci zkoumáme sestřihový komplex a jeho skládání v kontextu buněčného jádra z několika různých úhlů pohledu. Za prvé se věnujeme neočekávané souvislosti mezi sestřihovým faktorem U1-70K a komplexem SMN (z angl. survival of motor neurons), který je hlavním účastníkem biosyntetické dráhy malých jaderných ribonukleoproteinových částic. Podařilo se nám odhalit, že protein U1-70K interaguje s komplexem SMN a že tato interakce je klíčová pro stabilitu gems, malých nemembránových...
|
|
|
Functional and biochemical characterization of elF3 and elF3j in Saccharomyces cerevisiae and human cell lines
Wagner, Susan ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Staněk, David (oponent)
3 Abstrakt 3.2 český Translace se dělí na iniciaci, elongaci, terminaci a recyklaci ribozómů. Eukaryotický iniciační faktor (eIF) 3 je jeden z největších iniciačních faktorů a hraje důležitou roli ve většině reakcí během iniciace translace. Byl taktéž spojován s fází recyklace ribozómů. Nyní jsme však objevili jeho další funkci, a to v terminaci translace v kvasinkách, kde komplex eIF3 a jeho nestechiometricky vázaná podjednotka eIF3j/HCR1 ovlivňují terminaci translace a působí na rozpoznání STOP kodónu antagonisticky. Taktéž jsme charakterizovali funkci eIF3j v iniciaci translace. Strukturní analýza ukázala vazbu mezi evolučně konzervovaným tryptofanem v N-koncovém kyselém motivu (NTA) lidského eIF3j a hydrofóbní kapsou v RNA rozpoznávajícím motivu (RRM) lidského eIF3b. Tato vazba je konzervovaná rovněž v kvasinkách, kde zajištuje dostatečnou vazbu eIF3 na 40S ribozomální podjednotku. Má vliv na přesnost rozpoznání počátečního kodónu AUG, přičemž se zdá, že j/HCR1 při tom spolupracuje s eIF1A. Zjistili jsme, že první polovina j/HCR1 je v kvasinkách dostačující pro zajištění všech funkcí celého proteinu, které jsou zapotřebí pro růst přirozeného kmenu. Druhá polovina pak obsahuje evolučně konzervovaný specifický motif KERR, který je taktéž obsažen v HCR1-like doméně podjednotky a/TIF32. Tato část j/HCR1...
|
|
|
Transport U2 snRNA do Cajalových tělísek
Roithová, Adriana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent)
V jádře buňky můžeme nalézt velké množství malých nekódujících RNA, které zastávají nejrůznější důležité funkce. Mezi ně řadíme i malé jaderné RNA bohaté na uridin zvané U snRNA, které společně s proteiny tvoří U snRNP. Tyto částice hrají velmi důležitou roli v sestřihu pre-mRNA. Při tomto procesu jsou odstraňovány nekódující sekvence zvané introny a spojovány kódující sekvence zvané exony. Vše je katalyzováno sestřihovým komplexem, jehož jádro je tvořeno U1, U2, U4, U5 a U6 snRNP. Tyto částice jsou pro tuto posttrasnkripční úpravu zcela nepostradatelné. Některé kroky formování těchto U snRNP probíhají v jaderných strukturách zvaných Cajalovo tělísko (CB). V mé práci jsem se zaměřila na faktory, které jsou důležité pro cílení snRNA do Cajalových tělísek. Jako modelovou snRNA jsem použila U2 snRNA. Pomocí mikroinjekce fluorescenčně značených zkrácených U2 snRNA jsem zjistila, že pro cílení do CB je nezbytná sekvence, na kterou se váží Sm proteiny. Deplece Sm proteinu SmB/B'nám ukázala, že Sm proteiny jsou pro lokalizaci U2 snRNA do CB esenciální. Sm proteiny jsou formovány na U2 snRNA pomocí SMN komplexu. Odstranění sekvence v U2 snRNA, na kterou se SMN komplex váže, mělo stejný inhibiční efekt na cílení do CB jako deplece Sm proteinu. Z čehož vyplývá, že Sm proteiny a SMN komplex jsou nezbytné pro...
|
|
|
Mapping of SART3 interactions with spliceosomal snRNPs
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hnilicová, Jarmila (oponent)
Sestřih pre-mRNA je katalyzován obrovským a velmi dynamickým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (označovaných jako snRNP) a více než stovky dalších proteinů. Biogeneze sestřihových snRNP částic je komplikovaný proces, jehož závěrečné kroky se odehrávají ve specializovaných jaderných útvarech, Cajalových tělíscích. Molekulární podstata cílení snRNP částic do Cajalových tělísek však zůstává nejasná. Naše předchozí výsledky odhalily, že protein SART3 je důležitý pro akumulaci U4, U5 a U6 snRNP v Cajalových tělíscích, není ale známo, jakým způsobem SART3 tyto sestřihové částice váže. SART3 byl původně identifikován jako interakční partner U6 snRNP a faktor napomáhající složení U4/U6 di-snRNP částice. V této práci nicméně ukazujeme, že SART3 interaguje také s U2 snRNP a že specificky váže nesložené U2 částice. Dále poskytujeme důkazy, že SART3 asociuje s U2 snRNP přes Sm proteiny, které tvoří stabilní jádro čtyř z pěti hlavních snRNP částic (tzn. U1, U2, U4 a U5). Na základě našich výsledků navrhujeme, že interakce mezi SART3 a Sm proteiny představuje obecný mechanismus, jak SART3 rozpoznává nekompletní snRNP částice a kontroluje tak jejich skládání v Cajalových tělíscích.
|
|
|
Mapping the contact points between eukaryotic translation initiation factor eIF3 and the 40S ribosomal subunit.
Kouba, Tomáš ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Iniciace translace je u eukaryot vícestupňový proces vyžadující řízenou interakci několika eukaryotických iniciačních faktorů (eIF) spolu s malou ribozomální podjednotku tak, aby se správně vyhledal začátek translace mRNA a aby se správně dekódovala genetická informace, jež nese. Největší z těchto faktorů, eIF3, podporuje jiné iniciační faktory, aby se prostorově a koordinovaně umístili na povrchu ribozomu. Naší dlouhodobou snahou je zmapovat vazebné místo kvasinkového mnohapodjednotkového eIF3 na 40S ribozomu a zde uvádíme tři nové vzájemné interakce mezi těmito dvěma makoromolekulami (i) C-terminální oblast eIF3c/NIP1 podjednotky se skládá z konzervované PCI domény a my zde ukazujeme, že krátké zkrácení na C-konci tohoto proteinu nebo jeho dvě mutace v PCI doméně způsobují fenotyp pomalého růstu nebo jsou letální a výrazně snižují množství 40S-vázaného eIF3 in vivo. Krajní C-koncová část eIF3c/NIP1 přímo interaguje s ribozomálním proteinem malé podjednotky RACK1/ASC1, který je součástí hlavy malé podjednotky, a konzistentně, delece ASC1 zhoršuje vazbu eIF3 na ribozom. Doména PCI jako taková interaguje nespecificky s RNA, zde poprvé ukázaná, jakožto schopna interakce protein-RNA. Došli jsme k závěru, že c/NIP1 C-terminální oblast tvoří důležitý mezimolekulární most mezi eIF3 a 40S hlavou ribozomu...
|
|
|
Regulation of alternative splicing via chromatin modifications
Hozeifi, Samira ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Lanctôt, Christian (oponent)
Alternativní sestřih je jedním z mechanismů, který slouží k rozšiřování transkriptomu a proteomu v průběhu buněčného růstu, buněčné smrti, pluripotence, buněčné diferenciace a vývoje. Jak naznačují mnohé publikace, výběr sestřihového místa se odehrává v době, kdy je nascentní RNA v těsné blízkosti chromatinu. V této práci jsem se zaměřila na studium regulace alternativního sestřihu pomocí chromatinových modifikací, a to specificky na acetylaci histonů. V první práci popisujeme efekt inhibice histonových deacetyláz (HDACs), která ovlivňuje výběr sestřihového místa u ~700 genů. Ukázali jsme, že inhibice HDACs zvyšuje acetylaci na histonu H4 a posiluje procesivitu RNA polymerázy II (RNA pol II) v okolí alternativně sestřihovaného úseku. Dalším efektem inhibice HDACs je snížení asociace sestřihového faktoru SRp40, který reguluje sestřih fibronektinového alternativního exonu. Dále jsme ukázali, že Brd2 protein, který specificky váže acetylované histony, ovlivňuje transkripci 1450 genů. Po depleci Brd2 proteinu pozorujeme změnu v alternativním sestřihu u 290 genů. Na těchto a kontrolních genech jsme prozkoumali distribuci Brd2 proteinu a zjistili jsme, že Brd2 protein je lokalizován na promotorech ovlivněných genů. Dále jsme ukázali, že interakce Brd2 s chromatinem není závislá pouze na acetylovaných...
|
|
|
Recyklace sestřihových komplexů
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Ve většině lidských genů jsou kódující úseky (exony) přerušovány dlouhými nekódujícími sekvencemi (introny). Po přepisu genu do pre-mRNA musí být tyto introny velmi přesně vyštěpeny v procesu zvaném sestřih. Sestřih je zajišťován velmi složitým a dynamickým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (snRNP) a řady sestřihových proteinů. Každá částice obsahuje jednu malou jadernou RNA a několik specifických proteinů a vzniká postupným procesem, který se odehrává v jádře i cytoplazmě. Závěrečné úpravy pak probíhají v jaderných Cajalových tělíscích. Hotové částice nasedají v přesně daném pořadí na pre-mRNA a formují komplex, který katalyzuje dvě transesterifikační reakce potřebné k vystřižení intronu a spojení okolních exonů a následně se opět rozpadá na jednotlivé snRNP. Ribonukleoproteinové částice během sestřihu podstupují nejrůznější změny jak v konformaci, tak v proteinovém složení. Proto musí před každým dalším kolem sestřihu projít recyklačními úpravami a vrátit se do stavu vhodného pro připojení k novému sestřihovému komplexu. Recyklační fázi sestřihového cyklu nicméně zatím obklopuje více otázek než odpovědí. Cílem této práce je pokusit se ve světle nových poznatků alespoň na některé z nich odpovědět.
|
|
|
Efektory chromatinových modifikací a jejich vztah k regulaci transkripce na modelu Saccharomyces cerevisiae
Hálová, Martina ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Staněk, David (oponent)
Vztahy mezi transkripcí, úpravami primárního transkriptu a modifikacemi chromatinu jsou dosud jen nedostatečně poznány. Jedním z kandidátních faktorů, které tyto procesy spřahují, je lidský protein SNW1/SKIP. Tento protein je zapojen do regulace sestřihu pre mRNA a ovlivňuje transkripci jak na úrovni iniciace, tak na úrovni elongace. Podle hypotézy z laboratoře K. Jones je do procesu elongace transkripce zapojen prostřednictvím interakce s pozitivním transkripčním elongačním faktorem b a ovlivňuje také vznik methylace histonu H3 na lysinu 4, modifikaci spojenou s aktivní transkripcí (Bres et al., Genes Dev. 19:1211-26, 2005, Bres et al., Mol Cell. 36:75-87, 2009). Kvasinkový ortholog, protein Prp45, byl v literatuře dosud spojován pouze s regulací sestřihu. Nepublikované výsledky získané v naší a jiných laboratořích však poukázaly na jeho zapojení i do procesu elongace transkripce. Cílem diplomového projektu bylo hledat vztahy mezi Prp45 a faktory regulujícími transkripci. Bylo potvrzeno, že u buněk s mutací prp45(1-169) dochází ke zpoždění exprese genů PHO5 a PHO84. Byly zjištěny genetické interakce mezi PRP45 a některými geny kódujícími efektory chromatinových modifikací. Funkce Prp45 při expresi genů PHO5 a PHO84 byla dále blíže charakterizována testováním vlivu mutace prp45(1 169) a současné delece...
|
|
|
Analýza regulace komplexů cytoplazmatických poly(A) polymeráz
Novák, Jakub ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hrossová, Dominika (oponent)
Regulace genové exprese je dosahováno mnoha způsoby. Výzkum se dlouhá léta zaměřoval především na regulaci genové exprese na úrovni chromatinu, nicméně posttranskripční regulace se na cestě k syntéze proteinů ukazuje být jejím nezbytným doplňkem. Tato práce se zaměřuje na studium jednoho specifického mechanismu posttranskripční kontroly - regulace translace mRNA v buněčné cytoplazmě. Tato regulace je důsledkem rovnováhy mezi aktivací a represí translace a závisí na selektivním rozpoznání cílových mRNA RNA-vazebnými proteiny a jejich schopností navazovat proteiny modifikující RNA. V této práci byla zárodečná linie Caenorhabditis elegans využita ke studiu translační regulace mRNA genu hojně exprimovaného v zárodečné linii, gld-2. Mutanti známých RNA-vazebných proteinů z rodin proteinů PUF a CPB byli analyzováni pomocí Western blotů za použití protilátek proti GLD-2. K identifikaci cis-regulačních míst na gld-2 mRNA, zodpovídajících za regulaci translace PUF a CPB proteiny, bylo využito kvasinkového 3-hybridového systému. Také byl zkoumán potenciální autoregulační systém exprese genu gld-2. Tato práce ukazuje, že proteiny FBF pozitivně regulují expresi genu gld-2 a váží se na jednu konzervovanou sekvenci v nepřekládaném regionu na 3' konci jeho mRNA. Mutace v genu gld-2 negativně ovlivnily hladinu proteinu...
|
|
|
Spliceosome assembly
Hausnerová, Viola ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Chalupníková, Kateřina (oponent)
Introny jsou vystřiženy z eukaryotických transkriptů a exony jsou spojeny dohromady během procesu zvaného sestřih pre-mRNA. Sestřih je katalyzován sestřihovým komplexem. Jedná se o velký ribonukleoproteinový komplex složený z pěti malých jaderných RNA a více než stovky proteinů. Tento komplex rozpoznává 5' sestřihové místo, místo větvení a 3' sestřihové místo a následně provádí dvě transesterifikační reakce, jejichž výsledkem je zralá molekula mRNA. V rámci časného sestřihového komplexu je 5' sestřihové místo definováno pomocí U1 snRNP a na rozpoznání místa větvení a 3' sestřihového místa se podílí U2 pomocný faktor (U2 auxiliary factor, U2AF). Spolupráce sestřihových míst byla částečně popsána in vitro, ale situace in vivo není dosud zcela objasněna. V této studii jsme použili fluorescenční rezonanční energetický transfer (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) a RNA imunoprecipitaci (RIP) k popsání časných kroků skládání sestřihového komplexu. Abychom detekovali interakce proteinů na RNA molekule přímo v buněčném jádře, uplatnili jsme sestřihové reportéry kódující -globinový gen a vlásenky z fága MS2. Výsledky FRETu ukazují, že intaktní 5' sestřihové místo je vyžadováno pro vazbu U2AF35 na 3' sestřihové místo a že vazba U1C je částečně omezena v přítomnosti mutace 3' sestřihového místa. Dále jsme...
|
host ::
RSS.