|
|
Úloha signální dráhy ERK v regulaci genů časné odpovědi
Chvalová, Věra ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Doubravská, Lenka (oponent)
Signální dráha ERK představuje evolučně konzervovaný mechanismus, který buňkám umožňuje vnímat extracelulární signály a převádět je v široké spektrum specifických intracelulár- ních odpovědí, jako je proliferace, diferenciace, apoptóza či buněčná migrace. Mezi klíčové prvky této dráhy patří proteinkinázy Raf, MEK a efektorová proteinkináza ERK. Konstitutivní aktivace dráhy ERK, způsobená somatickými mutacemi některých jejích členů, se často objevuje u mnoha typů lidských nádorových onemocnění. Tato dráha proto hraje významnou roli i z biomedicín- ského hlediska. Zmíněné fyziologické i patologické děje jsou podmíněny především schopností signální dráhy ERK regulovat změny v expresi velkého množství genů. Po aktivaci proteinkinázy ERK dochází k její translokaci do jádra, kde fosforyluje rozličné transkripční faktory. To vede k jejich aktivaci a následně k několikastupňovým změnám v genové expresi. Nejdříve dochází k tran- skripci genů tzv. časné odpovědi (immediate early genes; IEGs), z nichž mnoho kóduje další tran- skripční faktory, jako jsou c-Fos, c-Jun či c-Myc. Ty následně regulují expresi genů tzv. sekun- dární odpovědi (secondary response genes, SRGs), které kódují další strukturní či signalizační proteiny. Hromadné změny v genové expresi poté vedou k funkčnímu přeprogramování buněk. V této...
|
|
| |
|
|
Spatiotemporal regulation of Lck activity in the initiation of TCR signalling
Ballek, Ondřej ; Filipp, Dominik (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Dizertační práce: Časoprostorová regulace aktivity kinázy Lck při zahájení TCR signalizace Ondřej Ballek Abstrakt T-lymfocyty jsou bezpochyby nejvíce studovanými buňkami imunitního systému. Jsou klíčovými hráči specifické imunity zodpovědnými za cílenou odpověď proti patogenům a jiným signálům nebezpečí. Díky jejich centrálnímu významu vede často jakákoliv porucha regulace jejich aktivity k imunopatologiím. Znalost jejich bio destruktivní efektorové funkce je tedy velice zásadní. Dodnes panují rozpory, jakým molekulárním mechanismem probíhá zahájení T-buněčné aktivace. Po rozeznání specifického antigenu prostřednictvím antigen-prezentující buňky a T-buněčného receptoru je aktivační signál přenesen přes plasmatickou membránu, kde následuje fosforylace cytoplasmatických částí T-receptorového komplexu. Tato událost je obecně považována za první biochemický znak aktivace T-lymfocytů v procesu zvaném "TCR triggering". Jak se však aktivační signál dostane do buňky a jaké mechanismy regulují samotné zahájení signalizace, jsou dvě základní, avšak dosud nezodpovězené, otázky. V této práci jsme se zaměřili především na mechanismy regulace T-buněčné aktivace a tři související problémy. V prvním jsme se zabývali časoprostorovou organizací důležitých signálních molekul před a po aktivaci T-lymfocytů v kontextu tzv....
|
|
|
Signaling mechanism in nuclear reorientation and its functional singnificance in cell migration.
Maninová, Miloslava ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Hodný, Zdeněk (oponent) ; Jaroš, Josef (oponent)
Prvním důležitým krokem buněčné migrace je ustavení buněčné polarity. Na procesu polarizace buněk se podílí řada signálních drah, jejichž regulace je v přední a zadní části buňky řízena různým způsobem. To buňce umožňuje zaujmout specifický tvar s typickou předo-zadní polaritou. Během polarizace buňka formuje vedoucí lamelipodii na přední části a váznoucí konec na zadní části buňky. Zároveň dochází k takovému přeuspořádání vnitrobuněčných organel, které je pro buněčnou migraci optimální. V migrujících buňkách, jako jsou fibroblasty, se buněčné jádro nachází v zadní části buňky a mikrotubuly organizující centrum relokalizuje mezi jádro a čelo buňky. Takové uspořádání uvnitř buňky je nezbytnou podmínkou pro efektivní směrovanou migraci. V této práci jsme ukázali, že pro polarizaci buněk je nezbytná také takzvaná reorientace jádra. Reorientace jádra je rotační pohyb, ke kterému dochází v prvních hodinách buněčné polarizace a umožňuje reorientaci delší osy jádra do směru migrace. Reorientace jádra pak napomáhá ustavení buněčné polarity a usnadňuje pohyb buněk. Aby buňka mohla reorientovat své jádro do směru migrace, je nutné, aby bylo napojeno na buněčný cytoskelet. Připojení jádra k jednotlivým komponentám cytoskeletu zprostředkovává takzvaný LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) komplex. V...
|
|
|
Radiation-induced plasticity of prostate cancer cells
Kyjacová, Lenka ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Bouchal, Jan (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Rezistence různých typů nádorů ke konvenční léčbě radiací nebo chemoterapeutiky patří mezi nejčastěji zkoumané fenomény v oblasti molekulární a klinické onkologie. Pro rekurentní onemocnění je charakteristická přítomnost metastáz, které jsou v 90% odpovědné za úmrtí pacientů. Frakcionované ionizující záření (fIR; fractionated ionizing radiation) v kombinaci s chirurgickým odstraněním nádoru nebo hormonální terapií představuje nejčastější typ léčby v případě lokalizovaného nebo lokálně pokročilého karcinomu prostaty (KP). Hlavní příčinou neúspěchu radioterapie KP je radiorezistence s následnou diseminací přeživších buněk do okolních tkání. Ve snaze lépe pochopit fenotyp buněk asociovaný s radiorezistencí jsme vystavili čtyři buněčné linie KP derivované z metastáz (DU145, PC-3, LNCaP a 22RV1) klinicky relevantním, denně se opakujícím dávkám ionizujícího záření (fIR; 35 x 2 Gy), což mělo za následek vznik dvou přeživších buněčných populací - adherentních buněk vykazujících známky senescence včetně exprese markerů asociovaných se senescencí a neadherentních buněk rezistentních k anoikis, s rysy kmenových buněk, včetně aktivní sinalizace Notch a exprese kmenových znaků CD133, Oct-4, Sox2 a Nanog. Zatímco radiorezistentní adherentní buňky byly schopné obnovit proliferaci krátce po skončení ozařování,...
|
|
|
Regulation of leukocyte signal transduction by adapter proteins with special focus on Csk anchoring proteins
Drobek, Aleš ; Brdička, Tomáš (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Signalizace přes receptory leukocytů je nedílnou součástí homeostáze imunitního systému a naprosto kritická pro imunitní odpověď. Iniciace signálu a jeho šíření musí být správně kontrolováno aby se aktivace imunitního systému nezvrhla v patologickou. Důležitou úlohu v zahájení signalizace a její regulaci hrají adaptorové proteiny. Tyto adaptory se podílejí na pozitivní nebo negativní kontrole, případně mají duální funkci. Jejich funkce je určena aktivitou enzymů, které na sebe váží. V předkládané práci jsme se zabývali dvěma adaptorovými proteiny, PSTPIP2 a LST1/A, a jejich funkcí v signalizaci leukocytů. Oba adaptory na sebe váží několik enzymů s inhibiční funkcí což poukazuje na jejich úlohu v negativní regulaci signalizace. Rozšířili jsme současné znalosti o vzniku a vývoji zánětlivého onemocnění označovaného jako chronická multifokální osteomyelitida, které se rozvíjí u myší v důsledku deficience v expresi adaptoru PSTPIP2, tím, že jsme popsali interakce tohoto adaptoru s kinázou Csk a fosfatázou SHIP1. Konkrétně jsme ukázali, že absence PSTPIP2 vede ke zvýšené aktivitě signálních drah a zvýšenému štěpení IL-1β v neutrofilech v odpovědi na celou řadu stimulací, a že vazba SHIP1 přispívá k potlačování zánětu zprostředkovanému adaptorem PSTPIP2. Biochemická analýza druhého adaptorového proteinu,...
|
|
|
Objasnění vlivu proteinkináz ERK1 a ERK2 na iniciaci translace nezávislé na čepičce
Přibyl, Miroslav ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Proteinkinázy ERK1 a ERK2 jsou jedny z nejstudovanějších proteinů buněčné signalizace. Oba proteiny se podílejí na velkém množství procesů ať už fosforylací proteinových substrátů nebo aktivací proteinkináz, které jsou součástí dalších signálních drah. Enzymy ERK1 a ERK2 jsou součástí MAPK/ERK signální kaskády, která je spojována s mnoha buněčnými ději, jakými jsou například buněčná proliferace, buněčný růst nebo diferenciace. Signální kaskáda MAPK/ERK je často silně aktivována v různých typech rakovinných bujení a je jedním z cílů vývoje nízkomolekulárních inhibitorů v léčbě nádorových onemocnění. Jednou z hlavních otázek základního výzkumu proteinů ERK1 a ERK2 je rozdílnost obou proteinkináz. Přestože mnohé poznatky poukazují na redundanci těchto proteinů, objevují se i poznatky tvrdící opak. Nedávná publikace skupiny Casanova et al. 2012 nepřímo poukazuje na rozdílný vliv proteinkináz ERK1 a ERK2 na iniciaci translace, která není závislá na čepičce, nýbrž na vnitřním vazebném místě pro ribozom, IRES. V Laboratoři biochemie RNA se už dlouho zabýváme iniciací translace zprostředkovanou HCV IRES (z ang. Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site, Vnitřní vazebné místo pro ribozomu viru žloutenky typu C). Tato diplomová práce vedla k zavedení metody RNA interference v naší laboratoři a vytvoření...
|
|
|
Identification of a new mechanism of Lck regulation via its C-terminal sequence
Valečka, Jan ; Filipp, Dominik (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Aktivace T-lymfocytů je složitý proces zcela zásadní pro správnou funkci imunitního systému. Jako takový byl v minulosti důkladně zkoumán a jeho základní rysy jsou velmi dobře popsány. Neplatí to ovšem pro všechny události, které během T-buněčné signalizace nastávají. Po stimulaci T-buněčného receptoru kináza Lck z rodiny Src zajišťuje spuštění signalizace fosforylací tyrosinů. Fosforylace dalších proteinů je závislá na přesunutí Lck do jiných kompartmentů plazmatické membrány, takzvaných lipidových raftů. V lipidových raftech je Lck v blízkosti svých substrátů, které a aktivuje a které následně spouští další signalizaci. Kritickou částí tohoto procesu je translokace Lck do lipidových raftů, jejíž mechanismus zůstává dosud neprozkoumaný, a jako takový je objektem značného akademického i klinického zájmu. Již dříve jsme identifikovali adaptorový protein RACK1 jakožto kandidátní protein zprostředkovávající redistrubuci Lck do lipidových raftů pomocí propojení Lck s mikrotubulární sítí. V této práci jsme analyzovali strukturní znaky a funkci RACK1 v interakci s Lck. S využitím buněčných linií SYF exprimující buď přirozené nebo různě mutované formy Lck zde ukazujeme, že plně funkční SH3 a SH2 domény Lck jsou nezbytné pro efektivní vytvoření komplexu RACK1-Lck. Také jsme zjistili malý, ale...
|
|
|
Úloha signální kaskády ERK v regulaci aktinového cytoskeletu a morfologických změn epiteliálních buněk
Rasl, Jan ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Signální kaskáda ERK patří mezi základní signální dráhy eukaryotických buněk, která reaguje na široké spektrum podnětů a následně se podílí na vytvoření konkrétní odpovědi. Ukazuje se, že signální kaskáda ERK indukuje rozpad architektury epitelu a indukuje morfologické změny vedoucí k zisku autonomie epiteliálních buněk. Během rozvolnění epiteliální struktury se signální kaskáda ERK účastní remodelace aktinového cytoskeletu, což má za následek ztrátu epiteliální polarity, rozvolnění mezibuněčných spojů a následně spuštění migračního programu, který umožňuje epiteliálním buňkám využít mezenchymálního způsobu migrace. Jednou z nejméně prozkoumaných aktinových struktur epiteliálních buněk je tzv. periferní aktin, kontraktilní aktinová struktura, která obemyká kolonie epiteliálních buněk. Periferní aktin se nachází na bazální straně buněk a pravděpodobně se podílí na udržení integrity epitelu. Nicméně dodnes není známo, jestli, a popřípadě jakým způsobem, se signální kaskáda ERK účastní na regulaci periferního aktinu a jestli remodelace periferního aktinu hraje roli v buněčné migraci. V této práci ukazujeme, že signální kaskáda ERK je důležitá pro remodelaci periferního aktinu. Akivace signální kaskády ERK vede k rozrušení této aktinové struktury a jejího nahrazení dendritickým aktinem lamellipodia a...
|
|
|
Vliv inhibice SH3 domény proteinu Crk na invazivitu nádorových buněk
Tomášová, Lea ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Protoonkogen Crk je spojován s nádory s agresivním a invazivním potenciálem. Protein Crk patří do skupiny adaptorových proteinů obsahujících SH2 a SH3 domény a hraje důležitou roli v buněčné signalizaci. Přes svoji SH2 doménu integruje signál přicházející od aktivovaných receptorů růstových faktorů a integrinů a předává jej na proteiny vázající jeho SH3 doménu. Ty potom aktivují malé GTPázy Rac1, Rap1 a Ras, které se podílí na regulaci buněčného pohybu, proliferace a přežívání. Cílem této diplomové práce bylo blokovat signalizaci proteinu Crk inhibicí jeho SH3 domény pomocí kompetitivního peptoidu, který váže SH3 doménu proteinu Crk s vysokou afinitou. Vazba tohoto inhibitoru na SH3 doménu brání navázání jejích buněčných vazebných partnerů a blokuje tak následný přenos signálu. V této diplomové práci byl analyzován vliv inhibice SH3 domény proteinu Crk na invazivní vlastnosti nádorových buněk. Pozorovaný inhibiční efekt na buněčnou invazivitu a schopnost buněk růst nezávisle na podkladu přináší důkaz o terapeutické relevanci cílení SH3 domény proteinu Crk pomocí peptoidového inhibitoru. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
host ::
RSS.