|
| |
|
| |
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
Strukturní biologie komplexu potkaních NK buněčných receptorů NKR-P1B a Clrb
Dvorská, Anna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
NK buňky mají důležitou roli v nespecifické imunitě organismů. Jejich schopností je rozpo- znat a zabít nádorové a virově infikované buňky bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je usměrňována množstvím stimulačních a inhibičních receptorů interagujících s li- gandy na cílové - nádorové či infikované buňce. Tato práce se zabývá přípravou a studiem komplexu potkaního NK buněčného inhibičního receptoru NKR-P1B ("natural killer cell re- ceptor - protein 1B") a jeho ligandu Clrb ("C-type lectin-related ligand b"). Clrb spouští inhibici NKR-P1B, což znamená, že pokud buňka exprimuje Clrb, nebude zničena. Při in- fekci potkaním cytomegalovirem ztrácí buňka ze svého povrchu Clrb a není tedy zabráněno jejímu zničení. Buňky infikované tímto virem se brání zničení pomocí exprese virového genu C-lektinového typu RCTL, jenž je homologem Clrb. Pro rekombinantní přípravu rozpustné formy těchto dvou receptorů potkaních NK bu- něk byla použita tranzientní transfekce linie lidských embryonálních ledvinných buněk 293 s jednoduchou glykosylací (HEK293S GnTI− ). Nativní formy receptorů - disulfidicky vázané homodimery - byly připraveny jako fúzní konstrukty s IgG Fc (s pomocí vektoru pYD5), které po odštěpení TEV proteasou poskytují čistě dimerní formu extracelulární části re- ceptorů bez jakékoliv afinitní...
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
Příprava rekombinantních forem extracelulární domény myších leukocytárních receptorů z rodiny NKR-P1.
Adámek, David
Myší receptory NK buněk patřící do rodiny NKR-P1 hrají roli v regulaci odpovědi těchto buněk z hlediska jejich aktivace, inhibice a produkce cytokinů. Tato diplomová práce se zabývá přípravou extracelulárních částí aktivačních receptorů mNKR-P1A a mNKR-P1C z myšího kmene C57BL/6. Cílem bylo připravit produkční vektor obsahující kódující sekvenci příslušných částí obou receptorů, optimalizovat jejich produkci v bakteriích E. coli a nalézt vhodný postup jejich renaturace a purifikace in vitro. Čisté proteinové preparáty byly následně ověřeny a analyzovány hmotnostní spektrometrií a rovněž značeny fluorescenční značkou za účelem hledání ligandu na buněčných preparátech. V budoucím výzkumu bude řešena struktura připravených proteinových preparátů a rovněž budou použity k hledání svých ligandů. Dané poznatky mohou v budoucnu dopomoci k lepšímu pochopení NK buněk.
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
Strukturní biologie komplexu potkaních NK buněčných receptorů NKR-P1B a Clrb
Dvorská, Anna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
NK buňky mají důležitou roli v nespecifické imunitě organismů. Jejich schopností je rozpo- znat a zabít nádorové a virově infikované buňky bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je usměrňována množstvím stimulačních a inhibičních receptorů interagujících s li- gandy na cílové - nádorové či infikované buňce. Tato práce se zabývá přípravou a studiem komplexu potkaního NK buněčného inhibičního receptoru NKR-P1B ("natural killer cell re- ceptor - protein 1B") a jeho ligandu Clrb ("C-type lectin-related ligand b"). Clrb spouští inhibici NKR-P1B, což znamená, že pokud buňka exprimuje Clrb, nebude zničena. Při in- fekci potkaním cytomegalovirem ztrácí buňka ze svého povrchu Clrb a není tedy zabráněno jejímu zničení. Buňky infikované tímto virem se brání zničení pomocí exprese virového genu C-lektinového typu RCTL, jenž je homologem Clrb. Pro rekombinantní přípravu rozpustné formy těchto dvou receptorů potkaních NK bu- něk byla použita tranzientní transfekce linie lidských embryonálních ledvinných buněk 293 s jednoduchou glykosylací (HEK293S GnTI− ). Nativní formy receptorů - disulfidicky vázané homodimery - byly připraveny jako fúzní konstrukty s IgG Fc (s pomocí vektoru pYD5), které po odštěpení TEV proteasou poskytují čistě dimerní formu extracelulární části re- ceptorů bez jakékoliv afinitní...
|
|
|
Příprava rekombinantních forem extracelulární domény myších leukocytárních receptorů z rodiny NKR-P1.
Adámek, David
Myší receptory NK buněk patřící do rodiny NKR-P1 hrají roli v regulaci odpovědi těchto buněk z hlediska jejich aktivace, inhibice a produkce cytokinů. Tato diplomová práce se zabývá přípravou extracelulárních částí aktivačních receptorů mNKR-P1A a mNKR-P1C z myšího kmene C57BL/6. Cílem bylo připravit produkční vektor obsahující kódující sekvenci příslušných částí obou receptorů, optimalizovat jejich produkci v bakteriích E. coli a nalézt vhodný postup jejich renaturace a purifikace in vitro. Čisté proteinové preparáty byly následně ověřeny a analyzovány hmotnostní spektrometrií a rovněž značeny fluorescenční značkou za účelem hledání ligandu na buněčných preparátech. V budoucím výzkumu bude řešena struktura připravených proteinových preparátů a rovněž budou použity k hledání svých ligandů. Dané poznatky mohou v budoucnu dopomoci k lepšímu pochopení NK buněk.
|
host ::
RSS.