|
Identifikace vláknitých hub pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie
ŠNAJDROVÁ, Martina
Metoda hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí/ionizací za přítomnosti matrice s průletovým analyzátorem (MALDI-TOF MS) využívá techniku tzv. měkké ionizace. Jedná se o rychle a stále se rozvíjející metodu, jenž našla uplatnění pro analýzu proteinů, glykoproteinů, nukleových kyselin, lipidů a vysokomolekulárních i nízkomolekulárních látek. Průlom přinesla tato metoda do rutinních mikrobiologických laboratoří. Pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie je možné provádět identifikaci aerobních i anaerobních bakterií, kvasinek, mykobakterií, ale též určit rod a druh vláknitých mikromycet. Kromě identifikace mikroorganismů je možné detekovat mechanizmy antibiotické rezistence bakterií (např. -laktamáz zodpovědných za inaktivaci -laktamových antibiotik). Jedná se o snadno použitelnou metodu identifikace, přesnější, rychlejší a nákladově efektivnější než dosud využívané biochemické testy a srovnání makroskopického a mikroskopického vzhledu. Hmotnostní spektrometrie MALDI TOF analyzuje hmotnostní spektra proteinů (bakterie) a glykoproteinů (houby), která jsou druhově specifická pro zkoumaný a určovaný kmen. Určení kmene probíhá srovnáním získaného hmotnostního spektra s referenční databází spekter. V období od ledna 2013 do února 2014 bylo v rámci praktické části vyšetřeno 114 izolátů vláknitých hub, přičemž 80 kmenů zachycených jako původci povrchových mykóz a 34 kmenů jako původci systémových a orgánových mykóz. Všech 114 vzorků bylo určeno jak klasickými metodami identifikace, tak i pomocí MALDI TOF MS. Vybraná skupina izolátů byla porovnána s molekulárně genetickými metodami (PCR) s následnou sekvencí amplikonu. MALDI TOF hmotnostní spektrometrie je jednoduchou metodou pro identifikaci bakterií. Při testování vláknitých mikromycet je kladen hlavní důraz na fázi přípravy vzorku před samotným testováním, bylo odzkoušeno několik pracovních postupů jejichž úspěšnost je shrnuta v této bakalářské práci.
|
|
Půdní mikromycety - potenciální zdroj N.sub.2./sub.O v půdách
Jirout, Jiří ; Šimek, Miloslav ; Elhottová, Dana
Cílem příspěvku je shrnout vědomosti o produkci N.sub.2./sub.O půdními mikromycety. Denitrifikace se předpokládala pouze u prokaryot, ale byly nalezeny důkazy produkce oxidů dusíku a N.sub.2./sub. i u hub. N.sub.2./sub.O houbového původu vzniká redukcí dusičnanů/dusitanů za anaerobních podmínek. Jelikož u hub byla nalezena schopnost používat denitrifikaci zároveň s respirací kyslíku, produkce N.sub.2./sub.O půdními houbami se dá předpokládat u širokého okruhu půd. Pro houby specifická nitrát/nitrit reduktáza (cytochrom P-450nor) byla objevena u druhu .i.Fusarium oxysporum./i.. Schopnost produkce N.sub.2./sub.O byla nalezena u dalších rodů mikromycetů (.i.Humicola, Cylindrocarpon, Trichoderma./i., atd.). Mnoho druhů mikromycetů nemá schopnost další redukce N.sub.2./sub.O na N.sub.2./sub.; u některých mikromycetů byla naopak popsána produkce N.sub.2./sub. pomocí tzv. kodenitrifikace.
|
| |
|
Diverzita anaerobních nálevníků
Nováková, Ludmila ; Čepička, Ivan (vedoucí práce) ; Kostka, Martin (oponent)
Nálevníci (Ciliata) jsou jednobuněčné eukaryotické organismy patřící do skupiny Alveolata. Dělí se na jedenáct tříd. Z toho se anaerobní/mikroaerofilní zástupci nacházejí ve třídách Armophorea, Litostomatea, Plagiopylea, Oligohymenophorea a Prostomatea. Anaerobní nálevníci mají mitochondrii redukovánu na hydrogenosom. V jejich cytoplasmě je okolo hydrogenosomů přítomno veliké množství metanogenních symbiontů. Anaerobní nálevníci jsou významní producenti metanu a jsou jak volně žijící, tak endobiotičtí (komenzálové, mutualisti či paraziti v zažívacím traktu mnohých živočichů včetně člověka). Podle dosud publikovaných studií se dá usuzovat, že diverzita anaerobních nálevníků je malá. Je to dáno tím, že se do fylogenetických studií zařazují pouze sekvence určených nálevníků a vynechávají se environmentální sekvence. Cílem této práce bylo získat sekvenční data co nejvíce volně žijících anaerobních nálevníků. Dohromady byly získány sekvence SSU rDNA 32 izolátů sladkovodních i mořských anaerobních nálevníků. Fylogenetická analýza ukázala, že většina jich patří do tříd Armophorea, Plagiopylea a Oligohymenophorea, kde tvoří několik samostatných fylogenetických linií. Kmen LIVADIAN společně s rody Paraspathidium, Askenasia, Urotricha, Cryptocaryon a nekultivovanými nálevníky náleží do třídy Prostomatea a...
|
|
Homology pyruvát:feredoxin oxidoreduktázy z hydrogenosomů Trichomonas vaginalis
Zedníková, Věra ; Hrdý, Ivan (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
Oxidativní dekarboxylace pyruvátu je důležitá reakce v metabolismu organismů vedoucí ke konzervaci energie. Enzym katalyzující tuto reakci u některých anaerobních či mikroaerofilních eukaryotních a prokaryotních organismů se nazývá pyruvát:feredoxin oxidoreduktáza (PFO). PFO obsahuje železo-sirné skupiny a váže tiamin pyrofosfát (TPP). V reakci katalyzované pomocí PFO, která může být i reverzibilní, vznikají z pyruvátu a CoA produkty acetyl-CoA, CO2 a uvolňují se dva elektrony. Tyto elektrony předává PFO nízkomolekulárním proteinovým přenašečům. Ve většině případů jsou tyto přenašeče feredoxiny, popřípadě flavodoxiny jako je tomu u bakterií fixujících dusík. Jeden z organismů vlastnící PFO jsou trichomonády, většinou parazitičtí či endosymbiotičtí anaerobní prvoci. PFO trichomonád se nachází v hydrogenosomech, organelách mitochondriálního typu. A právě PFO je jeden z klíčových enzymů v metabolismu hydrogenosomů Trichomonas vaginalis, sexuálně přenosného parazita člověka. PFO T. vaginalis je velmi důležitý enzym i co se lékařského významu týče. PFO je dle všeobecně přijímaného konceptu jeden z klíčových enzymů vystupující při aktivaci antimikrobiálních léčiv proti trichomoniáze 5-nitroimidazolů, mezi které patři i metronidazol. V genomu T. vaginalis bylo identifikováno celkem sedm PFO genů, které...
|
|
Reductive Evolution of Mitochondria - Related Organelles in Anaerobic Protist
Rada, Petr
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Katedra Parazitologie Doktorský studijní program: Parazitologie Abstrakt k disertační práci Reduktivní Evoluce Organel Mitochondriálního Původu u Anaerobních Protist Petr Rada Školitel: RNDr. Jan Tachezy, Ph.D. Školitel-konzultant: Doc. RNDr. Ivan Hrdý, Ph.D. Praha, 2011 ABSTRAKT Trichomonas vaginalis a Giardia intestinalis patří mezi parazitacká protista skupiny Excavata. Oba prvoci obsahují anaerobní formy mitochondrie, které se nazývají hydrogenosomy (Trichomonas) a mitosomy (Giardia). Hydrogenosomy produkují vodík a ATP substrátovou fosforylací. Mitosomy představují vysoce redukovanou formu mitochondrie, nepodílejí se na energetickém metabolismu buňky a neprodukují ani ATP. Během vývoje hydrogenosomu a mitosomu došlo k přenosu genetické informace do jádra hostitelské buňky a vzniku specializovaných transportérů, které zajišťovaly přenos metabolitů, iontů a transport proteinů kódovaných jádrem zpět do organel. Do dnešní doby máme pouze velmi omezené znalosti o proteinech a mechanismech, které se podílejí na biogenezi a transportu metabolitů a proteinů přes membrány obou typů organel. Dosavadní znalosti o proteomech mitosomů pocházejí většinou z analýz genomů vybraných protist a z ověřených mitosomálních lokalizací vytipovaných proteinů. Rozhodli jsme se...
|
|
Reductive Evolution of Mitochondria - Related Organelles in Anaerobic Protist
Rada, Petr ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Embley, Martin (oponent) ; Eliáš, Marek (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Katedra Parazitologie Doktorský studijní program: Parazitologie Abstrakt k disertační práci Reduktivní Evoluce Organel Mitochondriálního Původu u Anaerobních Protist Petr Rada Školitel: RNDr. Jan Tachezy, Ph.D. Školitel-konzultant: Doc. RNDr. Ivan Hrdý, Ph.D. Praha, 2011 ABSTRAKT Trichomonas vaginalis a Giardia intestinalis patří mezi parazitacká protista skupiny Excavata. Oba prvoci obsahují anaerobní formy mitochondrie, které se nazývají hydrogenosomy (Trichomonas) a mitosomy (Giardia). Hydrogenosomy produkují vodík a ATP substrátovou fosforylací. Mitosomy představují vysoce redukovanou formu mitochondrie, nepodílejí se na energetickém metabolismu buňky a neprodukují ani ATP. Během vývoje hydrogenosomu a mitosomu došlo k přenosu genetické informace do jádra hostitelské buňky a vzniku specializovaných transportérů, které zajišťovaly přenos metabolitů, iontů a transport proteinů kódovaných jádrem zpět do organel. Do dnešní doby máme pouze velmi omezené znalosti o proteinech a mechanismech, které se podílejí na biogenezi a transportu metabolitů a proteinů přes membrány obou typů organel. Dosavadní znalosti o proteomech mitosomů pocházejí většinou z analýz genomů vybraných protist a z ověřených mitosomálních lokalizací vytipovaných proteinů. Rozhodli jsme se...
|
|
Skrytá diverzita volně žijících trichomonád a jejich postavení v rámci skupiny Parabasalia
Céza, Vít ; Čepička, Ivan (vedoucí práce) ; Hampl, Vladimír (oponent)
Trichomonády (Parabasalia) jsou skupinou anaerobních jednobuněčných eukaryot. V současné době jsou řazeny do říše Excavata, přičemž toto zařazení bylo provedeno pouze na základě molekulárních analýz. Mezi trichomonády patří přes 400 převážně endobiotických druhů, z nichž zhruba 80 % žije v termitech. Volně žijících trichomonád bylo zatím popsáno pouhých šest druhů (Pseudotrichomonas keilini, Ditrichomonas honigbergii, Monotricho- monas carabina, Honigbergiella sp., Tetratrichomonas undula a Lacusteria cypriaca) tvoří- cích čtyři nezávislé fylogenetické linie. Z toho nám se podařilo popsat nový rod a druh Lacusteria cypriaca. Všechny tyto linie jsou sekundárně volně žijící, to znamená, že se v rámci trichomonád vyvinuly ze svých endobiotických předků. Podařilo se nám také publikovat první dvě sekvence příslušející druhu Pseudotrichomonas keilini, morfologicky popsaného již v roce 1935. Na základě našich dat jsme přesunuli Pseudotrichomonas keilini ze skupiny Honigbergiellidae do čeledi Trichomonadidae (řád Trichomonadida). Vedle těchto již publikovaných výsledků jsme získali dalších sedm nových kmenů volně žijících trichomonád (GOU23, CK, GR8, LAGOS2M, VAV1A1, E2NT, LAGOS2D), ze všech těchto kmenů jsme získali sekvenci genu pro SSU rRNA a provedli fylogenetickou analýzu. Tyto kmeny se rozpadly do...
|
host ::
