|
|
Structural studies of selected signaling protein complexes.
Pšenáková, Katarína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent)
Schopnost proteinů vázat jiné molekuly v reakci na různé podněty ve svém mikrookolí je základem rozsáhlých regulačních sítí, které koordinují následnou činnost buněk. Správná funkce těchto signálních drah závisí převážně na nekovalentních interakcích, které často ovlivňují strukturu proteinů a proteinových komplexů. Pochopení molekulárního mechanismu funkce proteinu v buněčné signalizaci je proto často závislé na znalosti jeho trojdimenzionální struktury. V této disertační práci představuji studie, které vedly na molekulární úrovni k pochopení několika protein-proteinových a ligand-proteinových interakcí podílejících se na buněčné signalizaci. Použila jsem nukleární magnetickou rezonanci (NMR), malo- úhlový rozptyl rentgenového záření (SAXS) a další biofyzikální metody pro určení molekulární podstaty inhibice čtyř signálních proteinů: vápník/kalmodulin (Ca2+ /CaM)- dependentní proteinkinasy kinasy 2 (CaMKK2); proteasy kaspasa-2; forkhead transkripčního faktoru FOXO3 a proteinkinasy ASK1. Konkrétněji byla zkoumána role proteinu 14-3-3 a CaM v regulaci CaMKK2 aktivity. Dále byl detailně studován mechanizmus, jakým protein 14-3-3 ovlivňuje schopnost oligomerizace a jaderné lokalizace kaspasy-2 a také byla objasněna podstata modulace transkripční aktivity FOXO transkripčních faktorů díky zkoumání...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Jiráček, Jiří (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Studium interakcí proteinkinasy CaMKK2 s kalmodulinem pomoci fluorescenční spektroskopie.
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkinasy jsou členy významné CaMK rodiny, která se účastní CaMK kaskády. Jedním z nich je Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkina- sakinasa 2 (CaMKK2), která je aktivována vazbou komplexu Ca2+ /CaM. CaMKK2 se od většiny ostatních proteinkinas liší zejména strukturou v blízkosti αE-helixu a auto- inhibiční domény. Protože se autoinhibiční doména překrývá s Ca2+ /CaM-vazebnou doménou, lze před- pokládat, že vazba kalmodulinu způsobuje strukturní změny v oblastech interagujících s autoinhibiční doménou a ovlivňuje přístupnost těchto oblastí pro jiné molekuly. Pro ověření tohoto předpokladu byl exprimován a vypurifikován mutant CaMKK2 W445F, v jehož sekvenci se nachází pouze jeden tryptofanový zbytek na pozici 374, který se nachází v blízkosti sledované oblasti helixu αE. Strukturní změny v této oblasti byly pozorovány prostřednictvím zhášení intenzity fluorescence tryptofanového zbytku Trp374 prostřednictvím akrylamidu.Tato měření mohou poskytnout informaci o přístupnosti sle- dované oblasti. Porovnání zhášení fluorescence v přítomnosti a nepřítomnosti kalmodu- linu naznačilo, že při interakci CaMKK2 s kalmodulinem dochází ve sledované oblasti v blízkosti Trp374 ke...
|
|
|
Role Polo-like kináz v regulaci buněčného cyklu a odpovědi na poškození DNA
Kudláčková, Radmila ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Šolc, Petr (oponent)
Při každém buněčném dělení musí dojít k rovnoměrnému rozdělení genetického materiálu do obou dceřiných buněk. V další fázi se musí chybějící část genomu dosyntetizovat. Celý cyklus podléhá regulaci ze strany cyklin-dependentních kináz (Cdk) ve spolupráci s cykliny. Dojde-li v průběhu buněčného cyklu k poškození DNA, signální dráhy kontrolních bodů potlačí průběh cyklem a zajistí, aby se buňka nedělila, dokud nebude zjednána náprava. Pokud kontrolní body neplní svoji funkci, dochází k nádorovému bujení. Polo-like kinázy (Plk) jsou stejně jako Cdk důležitými regulátory buněčného cyklu. Plní řadu funkcí především v mitóze, ale i v odpovědi na DNA poškození. Tato práce je zaměřena zejména na lidské homology, nicméně konzervovanost homologů mezi organismy je značná, tudíž uvedené poznatky mají obecnější platnost. Lidské buňky exprimují pět proteinů z rodiny Polo-like kináz, z nichž Plk1 odpovídá Polo-like kinázám nižších eukaryot. Poznatky o ostatních čtyřech kinázách jsou teprve na vzestupu.
|
|
|
Příprava thioredoxinu a thioredoxin-vazebné domény proteinkinasy ASK1 pro strukturní studie
Jarosilová, Kateřina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Kalábová, Dana (oponent)
Všechny živé organismy jsou v průběhu života vystaveny rozličným formám stresu. Možná právě proto se vyvinul evolučně velmi dobře konzervovaný systém MAPK (z anglického mitogen-activated protein kinase) signálních kaskád regulující buněčnou odpověď na stres. Tyto signální dráhy se skládají ze tří následujících tříd proteinkinas MAP3K, MAP2K a MAPK. Z MAPK je poté signál přenášen na další proteinkinasy nebo transkripční faktory. Proteinkinasa ASK1 (z anglického apoptosis signal-regulating kinase 1) je členem MAPK dráhy, konkrétně se řadí do třídy MAP3K, tedy mitogeny aktivovaná proteinkinasa kinasa kinasa. Lidská ASK1 je protein složený z 1374 aminokyselin uspořádaných do několika domén a sekvenčních motivů. Třemi hlavními doménami jsou N-terminální coil-coiled doména (NCC), serin/threoninová kinasová doména a C-terminální coil-coiled doména (CCC). Dále bylo v sekvenci charakterizováno několik míst, která jsou zodpovědná za interakci ASK1 s jejími vazebnými partnery. Aktivita ASK1 je totiž regulována různými faktory, mezi něž patří inhibitory thioredoxin a 14-3-3 proteiny. Naopak faktory TRAF (z anglického TNF receptor associated factor) proteinkinasu aktivují. Cílem této práce byla příprava šesti variant expresních konstruktů N-terminálního úseku sekvence lidské ASK1, který by měl být zodpovědný za...
|
|
|
In silico predikce posttranslačních modifikací
Basíková, Iveta ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Fišer, Karel (oponent)
Posttranslační modifikace mají důležitou úlohu v regulaci buněčných pochodů včetně metabolismu, růstu, diferenciace, transkripční aktivace, membránového přenosu a buněčného stárnutí. Experimentální detekce PTM (zejména fosforylace) za použití protilátek je stále časově i finančně náročná. Rozvoj in silico metod pro predikci fosforylace byl v posledních letech ovlivněn velkým nárůstem sekvenčních dat, které jsou vhodným zdrojem pro "trénink", zpracování a výslednou interpretaci predikčních výsledků. In silico predikce PTM může tedy usnadnit identifikaci potencionálních fosforylačních míst a urychlit tím základní výzkum.
|
host ::
RSS.