|
|
Predicting local structural properties from antibody sequence
Beňo, Roman ; Příhoda, David (vedoucí práce) ; Hoksza, David (oponent)
Predikce lokálních strukturních vlastností protilátek na reziduální úrovni je hodně důležitá pro detekci přítomnosti posttranslačních modifikací (PTM), které často indukují strukturální změny v protilátce, negativně ovlivňují její dlouhodobou skladovatelnost a vedou ke ztrátě jejího terapeutického potenciálu. V této práci predikujeme u jednotlivých reziduí relativní povrchovou dostupnost pro rozpouštědla (RSA). Tato vlastnost je spolu s typem dotyčné aminokyseliny klíčovým indikátorem přítomnosti oxidací methioninu a dalších typů PTM. Díky konzervovanosti struktury protilátek jsme zjistili, že různé třídy predikčních metod produkují téměř zaměnitelné výsledky - celková průměrná absolutní chyba (MAE) 5,64 procentních jednotek RSA pro nejvýkonnější z odzkoušených metod založených na strojovém učení, ve srovnání s hodnotou 5,96 naměřenou pro nejvýkonnější statistickou metodu. Výrazné zlepšení kvality predikce pozorované ve srovnání s metodou náhodné predikce s MAE 35,996 lze také připsat zachování struktury sekvence. V CDR oblastech je předpovědět hodnoty RSA obtížnější. Přestože metody a postupy, které v této práci používáme, zdaleka nejsou schopny poskytnout komplexní předpověď struktury, můžou se stát modulárním nástrojem s vysokou propustností pro návrh vhodných terapeutických protilátek. Klíčová slova:...
|
|
|
The impact of post-translational modifications on TRPC5 ion channel activation and modulation
Mitro, Michal ; Zímová, Lucie (vedoucí práce) ; Dolejší, Eva (oponent)
Transientní receptorový potenciálový kanonický kanál 5 (TRPC5), propustný pro vápenaté ionty, se uplatňuje jako receptor v senzorických neuronech, ledvinách a mozku, kde ovlivňuje zánětlivé procesy a různé typy bolesti. Přestože se předpokládá, že posttranslační modifikace významně ovlivňují vrátkování TRPC5 a jeho transport na membránu, bylo těchto procesů dosud popsáno poměrně málo. Za využití dostupných bioinformatických databází a dat z hmotnostní spektrometrie byla identifikována v rámci předložené práce fosforylační místa. Následně byla provedena funkční charakterizace těchto míst zavedením aspartátových (napodobujících fosfát) nebo alaninových (neumožňujících vazbu fosfátu) mutací pomocí cílené mutageneze. Technikou terčíkového zámku v uspořádání snímání aktivity z celé buňky byly zkoumány membránové proudy vyvolané napětím nebo působením agonisty. Výsledky ukázaly, že individuální záměny S193 a S195 z N-koncové domény za aspartáty významně zpomalují kinetiku vrátkování. Kromě toho byl u S193A pozorován fenotyp zesílení funkce kanálu. Molekulárně dynamické simulace naznačily, že fosforylace S193 způsobuje změny v interakcích mezi sousedními podjednotkami. Biotinylace navíc potvrdila, že změny aktivity mutací S193 nejsou způsobeny zvýšeným transportem proteinu na plazmatickou membránu....
|
|
|
In vitro selekce aptamerů pro methioninsulfoxid
Jureček, Matěj ; Míšek, Jiří (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Oxidace methioninu na methioninsulfoxid je jednou z důležitých redoxních posttranslačních modifikací proteinů. Tato modifikace může aktivovat i inhibovat funkci celé řady proteinů a je součástí regulačních mechanizmů různých (pato)fyziologických procesů. Pro výzkum dopadů a funkcí oxidace methioninu by bylo užitečné nalezení bioindikátoru pro methioninsulfoxid. Zatím však nebyla pro methioninsulfoxid v rámci proteinů nalezena žádná protilátka, ani žádný její ekvivalent. Tato práce se zabývala hledáním aptameru na bázi ssDNA, specifického svou vazbou na methioninsulfoxid pomocí metody in vitro selekce (SELEX). V rámci diplomové práce byla otestována řada různých podmínek pro in vitro selekci vůči methioninsulfoxidu. Žádné podmínky nevedly k obohacení počáteční knihovny a selektivní aptamer pro methioninsulfoxid se najít nepodařilo. Nelze vyloučit, že aptamer vůči methioninsulfoxidu lze nalézt, nicméně konvenční podmínky in vitro selekce jsou zřejmě nedostatečné pro tento úkol. V rámci kontrolního in vitro selekce byla získána výrazně obohacená ssDNA knihovna vůči sulforodaminu B jako ligandu. Sekvenace klonů z této obohacené knihovny ukázala přítomnost G-bohatých sekvencí, které jsou typické pro aptamery vůči sulforodaminu B, které byly již publikovány.
|
|
|
Tau protein, a biomarker of Alzheimer's disease: in vitro phosphorylation and tau-reactive antibodies characterization
Hromádková, Lenka ; Bílková, Zuzana (vedoucí práce) ; Fialová, Lenka (oponent) ; Krejsek, Jan (oponent)
Tau protein je s mikrotubuly asociovaný protein, který se nachází v axonech neuronů. Je klíčovou molekulou podílející se významně na patogenezi Alzheimerovy nemoci (AN), která je nejčastější příčinou stařecké demence. Tau patří do skupiny tzv. přirozeně nesbalených proteinů postrádajících globulární strukturu a vysoce náchylných k post-translačním modifikacím. Za patologických podmínek je tau protein abnormálně modifikován a chybně sbalován, což v důsledku vede k jeho oligomerizaci a agregaci do párově helikálních filament, které jsou základní jednotkou neurofibrilárních klubek, histopatologických útvarů typických pro AN. Současné léky používané v léčbě AN neurodegenerativní procesy pouze zpomalují a lék zcela zastavující vlastní rozvoj nemoci stále chybí. V současnosti je velmi slibným a rozvíjejícím se terapeutickým přístupem imunoterapie. Testována je také imunomodulace pomocí intravenózních imunoglobulinových preparátů (IVIG), které obsahují velké množství přirozených protilátek běžně se vyskytujících u zdravé populace. Objevení přirozeně se vyskytujících protilátek reaktivních s tau proteinem (nTau-Ab) v tělních tekutinách u pacientů s AD, zdravých kontrol, i jejich přítomnost v IVIG preparátech odstartovaly snahy lépe pochopit jejich úlohu u AN a jejich potenciální terapeutické využití....
|
|
|
MAP code and regulation of microtubule-based processes
Karhanová, Adéla ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Tomášová, Štěpánka (oponent)
Proteiny asociované s mikrotubuly (MAPs) jsou považovány za klíčové regulátory molekulárního transportu v buňkách. Ačkoli jejich nesprávné fungování vede k závažným patologiím, jako jsou neurodegenerativní poruchy, regulační role těchto proteinů zůstávají nejasné. Jelikož se MAPs váží na cytoskelet, musí být tato struktura pro funkci MAPs zásadní. Mikrotubulům, vysoce dynamickému typu cytoskeletální struktury, byla věnována zvláštní pozornost kvůli jeho asociaci s buněčným dělením a vitálními funkcemi v neuronech. Mikrotubuly mohou projít post-translačními úpravami, které ovlivňují molekulární motory a také vazbu dalších proteinů, jako jsou MAPs. Doposud není dostatečně zdokumentováno, jestli post-translační úpravy mikrotubulů regulují distribuci MAPs. Ukázalo se však, že MAPs spolupracují na vytváření soudržných obalů na mikrotubulech a regulují přístup molekulárních motorů a enzymů rozdělujících mikrotubuly. Jelikož existuje mnoho typů MAPs a ty se vzájemně vylučují, objevila se nedávno v literatuře hypotéza regulačního ‚MAP kódu '. Pomocí dostupné literatury se tato práce pokusí představit nový model MAP kódu a poskytnout některé základní informace o předchozím výzkumu v tomto tématu.
|
|
|
Proteomová analýza účinků protinádorových léčiv a charakterizace mechanismů nádorové rezistence
Hrabáková, Rita
Cílená onkologická léčba je namířena proti specifickým molekulám zodpovědným za karcinogenezi a růst nádorů. Účinek této efektivní terapie je však stejně jako u konvenční chemoterapie závislý na výbavě nádorových buněk, které mohou rozvíjet rezistenci. Pro studium mechanismů působení protinádorových léčiv a charakterizaci nádorové rezistence jsme využili modely lidských buněčných linií s různým fenotypem nádorového supresoru p53 a podrobily je kvantitativní proteomické analýze. Podařilo se nám identifikovat proteiny významně ovlivněné působením léčiv podobné struktury a také proteiny účastnící se rozvoje nádorové rezistence. Po ošetření buněk protinádorovými léčivy docházelo k bezprostřednímu ovlivnění buněčného metabolismu, který byl u rezistentních buněk modulován trvale. Zjistili jsme, že k rozvoji nádorové rezistence k působení inhibitorů Aurora kináz významně přispívá vysoká hladina proteinů serinhydroxymethyltransferázy, serpinu B5 a calretininu, které podporují progresi nádoru nezávisle na expresi proteinu p53. Voltage-dependent anion-selective channel protein 2 se účastní rozvoje rezistence pouze u nádorových buněk s funkčním p53 a tyto buňky vykazují také nízkou expresi elongačního faktoru 2. Buňky s mutovaným p53 pak během rozvoje rezistence posilují antioxidační mechanismy. Klíčovou...
|
|
|
Structural mass spectrometry of Bordetella virulence factors
Jurnečka, David
Bakterie rodu Bordetella jsou aerobní gramnegativní kokobacily, které osidlují dýchací trakt u řady savců a tím způsobují různé druhy respiračních onemocnění. Bakterie produkují velké množství adhesivních molekul a toxinů, které se výrazně podílejí na rozvoji infekce a potlačení hostitelského imunitního systému. Mezi hlavní zástupce patří filamentózní hemaglutinin (FHA), který zajišťuje přilnutí bakterie k řasinkovému epitelu hostitele, a adenylát cyklázový toxin (CyaA), který je schopen potlačit baktericidní aktivitu fagocytů. CyaA, společně s α-hemolysinem (HlyA) z Escherichia coli a RtxA cytotoxinem z druhu Kingella kingae, patří do rozsáhlé skupiny takzvaných Repeats-in-toxin (RTX) cytolysinů/hemolyzinů, které jsou post-translačně modifikovány pomocí acylace konzervovaných lyzinových zbytků. Cílem této práce je strukturně-funkční charakterizace FHA molekul a analýza post-translačních modifikací u RTX toxinů a jejich hybridních variant pomocí hmotnostní spektrometrie. Za prvé, diferenciální izotopické značení 16O/18O odhalilo, že C- koncové aminokyseliny vysoce homologních FHA proteinů z Bordetella pertussis a Bordetella bronchiseptica jsou štěpeny na různých místech, a to v pozici 2348 pro B. pertussis a v pozici 2479 pro B. bronchiseptica. Za druhé, proteomická analýza tryptických fragmentů...
|
|
|
Structural mass spectrometry of Bordetella virulence factors
Jurnečka, David
Bakterie rodu Bordetella jsou aerobní gramnegativní kokobacily, které osidlují dýchací trakt u řady savců a tím způsobují různé druhy respiračních onemocnění. Bakterie produkují velké množství adhesivních molekul a toxinů, které se výrazně podílejí na rozvoji infekce a potlačení hostitelského imunitního systému. Mezi hlavní zástupce patří filamentózní hemaglutinin (FHA), který zajišťuje přilnutí bakterie k řasinkovému epitelu hostitele, a adenylát cyklázový toxin (CyaA), který je schopen potlačit baktericidní aktivitu fagocytů. CyaA, společně s α-hemolysinem (HlyA) z Escherichia coli a RtxA cytotoxinem z druhu Kingella kingae, patří do rozsáhlé skupiny takzvaných Repeats-in-toxin (RTX) cytolysinů/hemolyzinů, které jsou post-translačně modifikovány pomocí acylace konzervovaných lyzinových zbytků. Cílem této práce je strukturně-funkční charakterizace FHA molekul a analýza post-translačních modifikací u RTX toxinů a jejich hybridních variant pomocí hmotnostní spektrometrie. Za prvé, diferenciální izotopické značení 16O/18O odhalilo, že C- koncové aminokyseliny vysoce homologních FHA proteinů z Bordetella pertussis a Bordetella bronchiseptica jsou štěpeny na různých místech, a to v pozici 2348 pro B. pertussis a v pozici 2479 pro B. bronchiseptica. Za druhé, proteomická analýza tryptických fragmentů...
|
|
|
Structural mass spectrometry of Bordetella virulence factors
Jurnečka, David ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent) ; Řehulka, Pavel (oponent)
Bakterie rodu Bordetella jsou aerobní gramnegativní kokobacily, které osidlují dýchací trakt u řady savců a tím způsobují různé druhy respiračních onemocnění. Bakterie produkují velké množství adhesivních molekul a toxinů, které se výrazně podílejí na rozvoji infekce a potlačení hostitelského imunitního systému. Mezi hlavní zástupce patří filamentózní hemaglutinin (FHA), který zajišťuje přilnutí bakterie k řasinkovému epitelu hostitele, a adenylát cyklázový toxin (CyaA), který je schopen potlačit baktericidní aktivitu fagocytů. CyaA, společně s α-hemolysinem (HlyA) z Escherichia coli a RtxA cytotoxinem z druhu Kingella kingae, patří do rozsáhlé skupiny takzvaných Repeats-in-toxin (RTX) cytolysinů/hemolyzinů, které jsou post-translačně modifikovány pomocí acylace konzervovaných lyzinových zbytků. Cílem této práce je strukturně-funkční charakterizace FHA molekul a analýza post-translačních modifikací u RTX toxinů a jejich hybridních variant pomocí hmotnostní spektrometrie. Za prvé, diferenciální izotopické značení 16O/18O odhalilo, že C- koncové aminokyseliny vysoce homologních FHA proteinů z Bordetella pertussis a Bordetella bronchiseptica jsou štěpeny na různých místech, a to v pozici 2348 pro B. pertussis a v pozici 2479 pro B. bronchiseptica. Za druhé, proteomická analýza tryptických fragmentů...
|
|
|
Mechanizmy regulace inhibičního faktoru IF1
Sklenář, Filip ; Dlasková, Andrea (vedoucí práce) ; Zelenka, Jaroslav (oponent)
Inhibiční faktor 1 (IF1) je jedním z hlavních regulátorů aktivity mitochondriální ATP syntázy, klíčového enzymu energetického metabolismu. Jsou známé jeho inhibiční účinky ve stavech jako je například hypoxie, nebo hladovění, avšak nejednotná je doposud hypotéza, zda IF1 inhibuje aktivitu ATP syntázy i za fyziologických podmínek. Poruchy regulace ATP syntázy mohou mít pro buňku fatální následky a byly popsány například u karcinogeneze a ischémie. Rovněž bylo zjištěno, že umlčení genu pro IF1 v pankreatických β-buňkách zvyšuje sekreci inzulinu, a tedy může mít IF1 význam v patogenezi diabetu 2. typu. Cílem této práce je shrnout aktuální poznatky týkající se proteinu IF1 a získat nové výsledky, které pomohou objasnit mechanismus, jakým tento protein reguluje mitochondriální ATP syntázu. Konkrétně se tato práce zabývá poměrem proteinu IF1 vůči ATP syntáze v pankreatických β-buňkách, v závislosti na různých kultivačních podmínkách. Dále zkoumá výskyt post- translačních modifikací proteinu IF1 v pankreatických β-buňkách (modelových buňkách INS-1E), které mohou hrát roli v regulaci aktivity IF1. Rovněž se zabývá poměrem buněčného ATP/ADP, který je jedním z klíčových faktorů pro sekreci inzulinu pankreatickými β-buňkami. Důležitou částí této práce jsou také experimenty na izolovaných jaterních...
|
host ::
RSS.