|
|
Modified ribonucleotides as building blocks for enzymatic construction of functionalized RNA or as antiviral compounds
Milisavljević, Nemanja ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Baszczyňski, Ondřej (oponent) ; Krečmerová, Marcela (oponent)
Cílem této práce bylo studovat vliv sterické náročnosti nukleosidtrifosfátů (NTPs) s modifikovanou bází na enzymatickou inkorporaci do RNA a také studie inhibice různých virových RNA polymeras těmito NTPs in vitro. Zároveň byly připraveny příslušné nukleosidy a proléčiva a byla testována jejich protivirová aktivita. V první části práce byly připraveny NTPs s různě objemnými substituenty; od malých (methyl a ethynyl), přes střední (fenyl a benzofuryl) až po velké (dibenzofuran). Aromatické substituenty byly zavedeny pomocí Suzukiho cross-couplingové reakce na jodovaných trifosfátech, nebo (v případě modifikovaných guanosinů) fosforylací modifikovaných nukleosidů. Methyl a ethynyl NTPs byly připraveny Pd-katalyzovanou cross-couplingovou reakcí s AlMe3, resp. Sonogashirovou reakcí, po které následovala fosforylace modifikovaného nukleosidu. Pro studium inkorporace do RNA pomocí T7 RNA polymerasy byly navrženy templáty kódující RNA o 35 bázích, které obsahují jednu, tři nebo sedm modifikací. Modifikované pyrimidinové trifosfáty dobře fungovaly pro všechny sekvence s výjimkou největších dibenzofuryl derivátů, které nebyly inkorporovány do sekvence se sedmi modifikacemi. V případě AR TPs se nukleotid s dibenzofurylovou skupinou neinkorporoval vůbec, zatímco ostatní modifikace byly tolerovány. Aby bylo...
|
|
|
Enzymatic synthesis of DNA modified in the minor groove
Matyašovský, Ján ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Hlaváč, Jan (oponent) ; Urban, Milan (oponent)
Souhrn V první části práce byla navržena a syntetizována řada šesti modifikovaných 2'- deoxyadenosintrifosfátů, nesoucí malé funkční skupiny (chlor, amino, methyl, vinyl, ethynyl a fenyl) na adeninu v poloze 2. Připravené nukleotidy byly testovány jako substráty pro DNA polymerázy v enzymatické syntéze DNA modifikované v malém žlábku. 2-Fenyl modifikovaný dATP byl jediným trifosfátem, který nebyl inkorporovaný, což znamená, že fenylová skupina je již příliš velká pro inkorporaci do malého žlábku. Všechny ostatní testované nukleotidy byly dobrými substráty pro testované DNA polymerázy [KOD XL, Vent(exo-) a Bst LF], což poskytlo modifikovanou DNA s malým žlábkem nesoucím jednu nebo čtyři modifikace. Modifikované DNA s vinylovou nebo ethynylovou skupinou byly poté použity pro modifikaci malého žlábku DNA fluorescenčními značkami za použití click reakcí. Ethynylová skupina reagovala v mědí katalyzované cykloadici alkynu s azidem (CuAAC), zatímco vinylová skupina se účastnila thiol- en-ové reakce. Tento postup umožnil připojení velkých funkčních skupin, které by jinak nemohly být instalovány do malého žlábku DNA pomocí přímé enzymatické inkorporace. Druhá část práce byla věnována studiu 2-alkylamino-2'-deoxyadenosin trifosfátů a jejich použití v enzymatické syntéze modifikovaných oligonukleotidů a DNA. N2 -alkyl...
|
|
|
Synthesis and studies of modified DNA: (i) development of DNA targeting molecular scissors and (ii) competitive enzymatic incorporation of base-modified nucleotides
Panattoni, Alessandro ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Urban, Milan (oponent) ; Fojta, Miroslav (oponent)
Souhrn V první části této práce byla vyvinuta série specifických umělých metalonukleáz (AMN), které konjugují sevřené fenanthrolinové měděné komplexy (Clip-Phen) s oligonukleotidy vytvářejícími triplex (TFO). Pro syntézu hybridů TFO-AMN bylo zkoumáno několik syntetických cest, přičemž všechny sdílely mědí katalyzovanou alkyn-azidovou cykloadici (CuAAC) jako klíčový krok. V důsledku toho byly připraveny stavební bloky pro enzymatickou nebo chemickou syntézu oligonukleotidů (ON) obsahujících klikací skupiny nebo již konjugované s ligandem Clip-Phen přes CuAAC. Byly navrženy a vyvinuty dva nové alkynyl modifikované nukleosid-5'-O-trifosfáty (dNTP), aby bylo dosaženo účinné polymerázové inkorporace klikacích alkynyl řetězců do ON a zároveň zvýšení účinnosti CuAAC reakcí na modifikované DNA. Byly také připraveny odpovídající 3'-O- fosforamidity, aby se pomocí chemické syntézy na pevné fázi vložily stejné alkynylové linkery do ON. AMN byla připojena na 5'- nebo 3'- koncích nebo uprostřed TFO úseku pomocí různých linkerů. Byla studována hybridizace všech syntetizovaných TFO s duplexem DNA obsahujícím cílovou sekvenci. Nakonec byla provedena rozsáhlá studie účinnosti štěpení a specificity konjugátů TFO-AMN vůči cílové DNA, přičemž se zkoumal vliv vlastností hybridů a reakčních parametrů. Ve druhé části této práce...
|
|
|
Construction of modified DNAs with selected reactive or protective groups
Vaníková, Zuzana ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Křen, Vladimír (oponent) ; Zimčík, Petr (oponent)
Tato dizertační práce je zaměřená na syntézu DNA modifikované pomocí fotolabilních 2-nitrobenzylových chránících skupin a jejich aplikace v procesu regulace genové exprese. V první části mojí disertační práce je popsaná syntéza 2'-deoxyribonucleozid trifosfátu chráněných fotolabilními chránicími skupinami a jejich fotolýza na odchráněné hydroxymethylové trifosfáty. Všechny připraveny nukleosid trifosfáty byly dobrými substráty pro jejich enzymatickou inkorporaci do DNA. Syntetizovaný 5-(2-nitrobenzyloxy)methyl-2'- deoxyuridin-5'-monofosfát (dUNBMP) a DNA s jednou 5-(2-nitrobenzyloxy)methyl- modifikaci v sekvenci byli použity v podrobné studii kinetiky fotolytických reakcí. V druhé časti disertační práce byla připravena série modifikovaných DNA se specifickou sekvenci pomoci PEX a/nebo PCR. Štěpení modifikované DNA bylo studováno v přítomnosti vybraných restrikčních endonukleáz (RE). Ve všech případech byla DNA modifikovaná nitrobenzylovými skupinami úplně rezistentní vůči štěpení RE. V případě hydroxymethylové DNA s pozitivním štěpením pomoci RE, byly studovaný podmínky ochránění 2-nitrobenzylových zbytku na DNA, tedy 2-nitrobenzylové skupiny se jeví jako využitelné, bioortogonální přechodní chránění DNA proti štěpení restrikčními endonukleázami. V závěrečné časti, byly syntetizované...
|
|
|
Study on the Electrophoretic Behaviour of Short Oligodeoxyribonucleotides in Fused Silica Capillaries. A Preliminary Communication
Vítová, Lada ; Fojta, Miroslav ; Vespalec, Radim
Effects of background electrolyte pH, composition and concentration on the electrophoretic transport of short oligodeoxyribonucleotides (ODNs) in fused silica capillaries have been investigated in the presented study. Mobilities and separation efficiencies of ODNs peaks varied with all three background electrolyte characteristics. Just changes in the background electrolyte characteristics and acid-base properties of ODNs are not sufficient for a systematic explanation of the observed variations. Despite the indicated complexity of ODNs electrophoretic behaviour, we show that very high separation efficiencies of ODNs peaks can be achieved in background electrolytes of physiological pH.
|
|
|
New redox labels for DNA
Simonova, Anna ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Urban, Milan (oponent) ; Vyskočil, Vlastimil (oponent)
Cílem mé disertace byla syntéza modifikovaných 2'-deoxyribonukleosid trifosfátů (dNTP) nesoucích elektrochemicky oxidovatelné značky a jejich inkorporace do DNA pro aplikace v bioanalýze. V první části disertace jsem vyvinula syntézu modifikovaných dNTP nesoucích 2,3- dihydrobenzofuran (DHB) nebo 2-methoxyphenol (MOP) v poloze 5 u 2'-deoxycytidin-5'-O- trifosfátu a v poloze 7 u 7-deaza-2'-deoxyadenosin-5'-O-trifosfátu pomocí Suzukiho- Miyaurových cross-coupling reakcí. Poté byly modifikované dNTP využity jako substráty pro DNA polymerasy při enzymové syntéze modifikovaných DNA pomocí PCR nebo prodlužování primeru. Studovali jsme elektrochemické vlastnosti nukleosidů, dNTP a DNA značených DHB nebo MOP skupinami s použitím metod square-wave voltametrie (SWV) na pyrolytické grafitové elektrodě (PGE) a pozorovali signály oxidace MOP při cca. 0.5 V a oxidaci DHB při 0.85V. Využití DHB skupiny v kombinaci s dalšími redoxními značkami bylo limitováno blízkostí pozice jejího oxidačního píku k signálům přirozených nukleobází, zatímco MOP skupina byla úspěšně použita k redoxnímu kódování nukleobází v kombinaci s aminofenylovou nebo benzofurazanovou značkou, kdy každá značka poskytla odlišný a nezávisle detekovatelný redoxní signál. V druhé části disertace jsem studovala fenothiazin (PT) jako novou redoxní...
|
|
|
Příprava a enzymatická inkorporace deoxyribonukleosid trifosfátů odvozených od pyrimido[4,5-b]indolu do DNA pomocí vybraných polymeras
Bosáková, Andrea ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá syntézou pyrimido[4,5-b]indolových 2'- deoxynukleosidů a jejich následnou trifosforylací. Celkem byly připraveny tři nové analogy 2'-deoxyadenosin trifosfátu s anelovaným benzenovým jádrem. Dále byla zkoumána schopnost vybraných DNA polymeras inkorporovat celkem čtyři modifikované 2'-deoxyribonukleotidy do oligonukleotidového řetězce pomocí tzv. primer extension (PEX) metody. Všechny modifikované 2'- deoxyribonukleotidy byly inkorporovány do oligonukleotidového řetězce, avšak úspěšnost následné elongace se lišila v závislosti na použité DNA polymerase a substituentu v poloze 6 ve struktuře substrátu. (In Czech) Klíčová slova nukleosidy, modifikované nukleotidy, DNA polymerasy, PEX reakce
|
|
|
Stanovení adenosintrifosfátu a adenosindifosfátu v reálných vzorcích
Černá, Martina ; Coufal, Pavel (vedoucí práce) ; Zima, Jiří (oponent)
Úkolem tohoto diplomového projektu bylo nalézt vhodné podmínky pro stanovení dvou běžných nukleotidů adenosindifosfátu a adenosintrifosfátu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie a provést jejich analýzu v reálných vzorcích citrusových plodů a extraktů z rostlin. Dalším cílem bylo zjistit limity detekce a stanovení obou nukleotidů při těchto optimalizovaných podmínkách měření a pomocí těchto limitů porovnat citlivost používaných detektorů. K zjištění zkoumaných nukleotidů byly využity instrumentace HPLC-UV, kapilární HPLC-DAD a HPLC-MS. Pomocí HPLC s UV detekcí a kapilární HPLC s detektorem diodového pole byly proměřeny kalibrační závislosti směsi analytů a určeny limity detekce a stanovení adenosindifosfátu a adenosintrifosfátu. K rozdělení analytů až na základní linii pomocí HPLC-UV a kapilární HPLC-DAD došlo za podmínek iontově párové chromatografie. Vhodnou kolonou byla kolona C18. Mobilní fáze obsahovala fosfátový pufr, acetonitril a tetrabutylamonium bisulfát jako iontově párové činidlo. Dělení probíhalo při gradientové eluci. U LC-MS byly zjišťovány podmínky analýzy ADP a ATP. Při vysokoúčinné kapalinové chromatografii s hmotnostní detekcí bylo dosaženo rozdělení analytů na koloně C18, fenyl-hexylové koloně a koloně Zic HILIC. Mobilní fáze protékající kolonou C18 obsahovala 99:1 (v/v)...
|
|
|
Analýza adenosintrifosfátu a adenosindifosfátu pomocí HPLC-MS/MS
Černá, Martina ; Coufal, Pavel (vedoucí práce) ; Bosáková, Zuzana (oponent)
V této bakalářské práci byly analyzovány a detekovány vzorky adenosindifosfátu a adenosintrifosfátu pomocí metody HPLC-MS/MS. V rámci tohoto bakalářského projektu byly nalezeny orientační limity detekce (LOD) studovaných látek a tyto hodnoty byly porovnány s LOD zjištěnými v literatuře při použití stejných metod a velmi podobných experimentálních podmínek. Stanovené limity detekce nukleotidů byly srovnatelné s limity detekce v literatuře. Analýza pomocí hmotnostní spektrometrie byla prováděna při mnohonásobném reakčním monitorování v pozitivním i negativním módu a k ionizaci analytů došlo elektrosprejem. Optimálních podmínek pro analýzu ADP a ATP pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie bylo dosaženo použitím kolony ZIC - HILIC s mobilní fází o složení 75:25 (v/v) acetonitril / 10 mM octan amonný. Octan amonný měl pH nastavené na hodnotu 7,15 a dělení probíhalo při izokratické eluci.
|
|
| |
host ::
RSS.