|
|
Separace fosfolipidů metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie
Erdeová, Karolína ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Sobotníková, Jana (oponent)
Fosfolipidy jsou součástí buněčných membrán všech živých organismů. Jedná se o nejvýznamnější skupinu polárních lipidů, vyznačující se amfifilními vlastnostmi. Tyto vlastnosti vyplývají z jejich molekulární struktury, která se skládá z hydrofobních mastných řetězců a polární hlavice. Podle polární hlavice se dělí fosfolipidy do příslušných tříd. Poměr fosfolipidových tříd, zastoupených v bakteriální membráně, značně odráží životní pochody mikroorganismu. Pomocí změn v zastoupení těchto tříd lze sledovat vliv vnějšího prostředí, čehož se využívá v mikrobiologickém výzkumu. Pro sledování fosfolipidového složení vyšlechtěného kmene Bacillus subtilis, který je intenzivně zkoumán pro produkci antibiotik, se stále využívá tenkovrstvá chromatografie. Její časová náročnost výzkum značně zpomaluje, a proto byly podmínky tohoto uspořádání přeneseny na HPLC. Pro tyto účely byla metoda optimalizována formou nelineárního gradientu. Vhodnost metody byla testována na vzorku bakteriálních membránových lipidů, který obsahoval pět fosfolipidových tříd, z čehož dvě majoritní. Jejich poměrné zastoupení lze stanovit, nicméně je nutno pečlivě volit objem nastřikovaného vzorku, aby se zabránilo překročení úzkého koncentračního rozsahu metody. Klíčová slova: fosfolipidy, HPLC, optimalizace, validace, HILIC, NP-HPLC
|
|
|
Vývoj analytických metod pro stanovení fosforylovaných složek bakteriálních buněčných membrán
Mikulecká, Jana ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Feltl, Ladislav (oponent)
Fosfolipidy jsou dominantními komponentami bakteriálních buněčných membrán, v nichž tvoří fosfolipidové dvojvrstvy. Bakterie se liší svým fosfolipidovým složením, což umožňuje stanovení a identifikaci významných skupin mikroorganismů. Lze však sledovat i změnu fosfolipidového zastoupení u bakterií stejného druhu, protože složení je ovlivněno celou řadou environmentálních podmínek. K identifikaci a stanovení bakteriálních fosfolipidů se běžně využívá tenkovrstvá chromatografie zejména pro svou minimální instrumentaci. Nevýhodou této metody je časová náročnost a požadavky na pečlivost a zručnost pracovníka. Rostoucí zájmem o fosfolipidové dvojvrstvy napomáhá k podrobnějšímu prozkoumání složení mastných kyselin, neboť detailnější analýzy umožňují zjistit o mikroorganismech ještě více. Pro tyto účely se zdá být tou nejlepší volbou plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií. Metoda slouží jak k identifikaci, tak k určení celkového zastoupení mastných kyselin v molekule fosfolipidu. Dále je využívána k určení polohy a počtu izomerií dvojných vazeb a funkčních skupin na uhlovodíkovém řetězci. Zatímco pro identifikaci a stanovení nepolárních částí fosfolipidů již existuje vhodná a osvědčená analytická ...
|
|
|
Přenos nabitých a nenabitých částic přes modelové biologické membrány
Parisová, Martina ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Tato práce je zaměřena na přípravu modelových stabilizovaných fosfolipidových membrán utvářených na porézním polykarbonátovém nosiči. Pro jejich utváření v pórech hydrofilního polykarbonátového nosiče byl použit 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- fosfocholin. Pro charakterizaci formování fosfolipidových vrstev, jejich změn a studium transportních procesů byla využita elektrochemická impedanční spektroskopie a voltametrie. Transport kademnatých a měďnatých iontů byl studován v přítomnosti ionoforu calcimycinu a při jeho absenci, který byl inkorporován do vytvořené fosfolipidové membrány. Protože jsou uvedené ionty často vázány v komplexech s různými látkami, jako jsou nízkomolekulární organické kyseliny (low molecular weight organic acids, LMWOAs), byla tato práce zaměřena také na přenos měďnatých a kademnatých iontů přes modelové fosfolipidové membrány v přítomnosti kyseliny jablečné, citronové a šťavelové při různém pH. Kromě použitého ionoforu byly provedeny pilotní experimenty přenosu měďnatých iontů za pomoci dvou peptidů, nisinu a transportanu 10. Utváření membrány a transportní procesy byly charakterizovány pomocí dvou navržených náhradních elektrických obvodů, které odpovídají situaci pokrytého a nepokrytého polykarbonátového nosiče. Klíčová slova: Fosfolipidy, Membrány, Ionofor, Peptid,...
|
|
|
Stanovení lipidového profilu v biologickém materiálu metodou HPLC-ELSD
Vaindlová, Petra ; Pacáková, Věra (vedoucí práce) ; Feltl, Ladislav (oponent)
Byla optimalisována metoda kapalinové chromatografie s evaporativním detektorem rozptylu světla (HPLC-ELSD) pro stanovení neutrálních a polárních lipidů. Jako stacionární fáze byla využita kolona plněná silikagelem s chemicky vázaným diolem. Jako mobilní fáze sloužil ternární gradient o složení A: hexan-tetrahydrofuran 99:1 (v/v), B: isopropanol-chloroform- kyselina octová 82:20:0,01 (v/v/v), C: isopropanol-voda-triethylamin 47:47:6 (v/v/v). Kalibrační závislosti byly měřeny v rozsahu 2-200 μg v nastřikované dávce a pro jednotlivé lipidové třídy odpovídalo optimální proložení experimentálních bodů těmto funkcím: triacylglyceroly - polynom 3. stupně (R=0,998), estery cholesterolu - mocninná závislost (R=0,998), volný cholesterol - polynom 3. stupně (R=0.9998), ceramid - mocninná závislost (R=0,992), kardiolipin - kvadratická závislot (R=0,998), fosfatidylethanolamin - mocninná závislost (R=0,999), fosfatidylcholin - kvadratická závislost (R=0,997), fosfatidylserin - polynom 3. stupně (R=0,9985), sfingomyelin - polynom 3. stupně (R=0,9997), lysofosfatidylcholin - mocninná závislost (R=0,9986). Analysa synthetického kontrolního vzorku ukázala výtěžnost v rozmezí 82-95%. Na základě těchto měření byly pak stanoveny koncentrace jednotlivých lipidových tříd v mozkové tkáni u myších samic a třicetidenních...
|
|
|
Hemoglobin-mediated oxidation of marine liposomes
Škrabalová, Lada ; Mozuraityte, Revilija (oponent) ; Rustad, Turid (vedoucí práce)
The objective of this work was to study the kinetics of lipid oxidation catalyzed by bovine methemoglobin and to evaluate the effects of different experimental conditions and different antioxidants (EDTA, ascorbic acid, caffeic acid, a-tocopherol, d-tocopherol, astaxanthin and L-ascorbic acid-6-palmitate) on the methemoglobin-mediated lipid oxidation in a marine phospholipid liposome model system. The oxygen uptake was used for monitoring lipid oxidation at pH 5.5 and 30 °C. The type of prooxidant and the concentration of both prooxidant and antioxidant (AOX) were found to be very important factors in the evaluation of the antioxidant activity in the liposome model system. Another important factors are the structure of the antioxidant molecule, its hydrophility/lipophility and its location in the system. All antioxidants, except 0.1 % of astaxanthin and 0.1 % of ascorbyl palmitate, inhibited metHb-induced lipid oxidation in all tested concentrations of the AOX. The efficiency of the AOX increased with their increasing concentration. 0.1 % of astaxanthin had no effect on the oxidation of liposomes. 0.1 % of ascorbyl palmitate had a prooxidative effect which can be explained by the prooxidative action of ascorbyl radical, which could promote hydroperoxide scission. Free iron released from metHb contributed little to metHb-mediated lipid oxidation in liposomes, whereas part of the prooxidant activity of metHb was attributed to the formation of singlet oxygen (metHb as a photosensitizer). The antioxidative activity of astaxanthin, ascorbyl palmitate, and tocopherol can be partly attributed to their singlet oxygen quenching ability. However, the main prooxidative mechanisms of metHb are suggested to be decomposition of lipid hydroperoxides, generating free radicals, and formation of hypervalent forms of Hb. EDTA inhibited oxidation of liposomes by chelating transition metals in liposomes and chelating free iron from the metHb solution. The reduction of hypervalent forms of Hb seems to be a very important antioxidant mechanism and was found to be attributed to ascorbyl palmitate, ascorbic acid (AsA) and caffeic acid (CaA). AsA, CaA, tocopherols and astaxanthin inhibit metHb-mediated lipid oxidation by scavenging of lipid radicals. No significant effect of hydrogen peroxide on the oxidation of liposomes was observed. The oxidation was slightly inhibited due to thermal treatment of metHb solution. A significant inhibition of oxygen uptake rate was observed in liposomes containing TPP (triphenylphosphine), which suggests that the heme-mediated lipid oxidation in liposomes is dependent on the presence of pre-existing lipid peroxides. The outcomes of this work can be used for the study of oxidation of liposome solutions, cell membranes and oil-in-water emulsions stabilized by phospholipids; the results contribute to understanding the prooxidant and antioxidant mechanisms and factors that influence oxidation in these systems.
|
|
|
Interakce fosfolipidů s polyelektrolyty ve vodném prostředí
Maivaldová, Iva ; RNDr.Miroslav Gál, Ph.D. (oponent) ; Klučáková, Martina (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřena na stanovení agregačního chování vybraných fosfolipidů (lecitin; 1,2-dipalmitoy-sn-glycero-3-fosfocholin) ve vodě a jeho ovlivnění přídavkem nativního hyaluronanu o různých molekulových hmotnostech a koncentracích. Toto chování bylo sledováno pomocí fluorescenční spektroskopie za využití pyrenu a perylenu jako fluorescenčních sond schopných penetrovat do hydrofobních kavit formovaných agregátů. Byla stanovena kritická agregační koncentrace a koncentrace odpovídající počátku agregace lecitinu. Pro 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin bylo možno stanovit pouze počátek agregace. Hodnoty tohoto parametru si pro lecitin a 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin řádově odpovídají. Bylo zjištěno, že přídavek nativního hyaluronanu má pouze v některých systémech nepatrný vliv na agregační chování vybraných fosfolipidů.
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.