|
|
Ubiquitin-proteasome system in studies of its inhibition and its utilization in the cell-based assay measuring viral protease activity
Fürst, Eliška ; Majerová, Taťána (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
a klíčová slova Abstrakt a klíčová slova Ubikvitin-proteazomální systém (UPS) je specificky regulovaná dráha degradace proteinů. Inhibice komponentů UPS může představovat budoucnost léčení lidských nemocí, zejména rakoviny. Modulace UPS však může být i užitečným nástrojem základního výzkumu. Práce se zabývá dvěma nezávislými, avšak metodologicky propojenými, výzkumnými cíli - prvním cílem je hledání substrátu UPS inhibitoru CBU79 a druhým cílem je vývoj buněčného reportérového systému pro sledování aktivity proteáz založený na proteinové degradaci. V první části práce jsme potvrdili dřívější poznatky mechanismu inhibice UPS. Dále jsme pomocí metabolického značení proteinů založeného na click chemii zkoumali, jak UPS inhibitor CBU79 ovlivňuje syntézu proteinů. Analyzovali jsme též cytotoxicitu inhibitoru CBU79 na různých buněčných liniích. Nakonec jsme provedli celogenomové testování pomocí technologie CRISPR/Cas9 s cílem nalezení substrátu tohoto inhibitoru. Zjistili jsme, že inhibitor CBU79 negativně ovlivňuje syntézu proteinů pravděpodobně přes signalizaci buněčné odpovědi na špatně sbalené proteiny. Pomocí tohoto testování jsme nalezli 22 možných cílů inhibitoru, které budou ověřeny v dalších pracích. Ve druhé části práce jsme využili znalosti UPS k navržení neinfekční reportérové buněčné eseje,...
|
|
|
Zobrazování fluorescenčně značených mitochondrií metodou Biplane_FPALM
Dostál, Marek ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Valenta, Jan (oponent)
Název práce: Zobrazování fluorescenčně značených mitochondrií metodou Biplane FPALM Autor: Bc. Marek Dostál Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí práce: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. Konzultanti: RNDr. Petr Ježek, DrSc. Mgr. Hana Engstová, Ph.D. Abstrakt: V této práci jsme hledali a nalezli vhodné PCFP markery pro vizualizaci vnitřní a vnější membrány mitochondrií na unikátním prototypu biplane FPALM mikroskopu. Podíleli jsme se na odlaďování měřicího softwaru za účelem 3D vizualizace mitochondriálních sítí a určení jejich parametrů. K tomuto účelu jsme vyvinuli dvě metody. Jedna je použitelná při určování parametrů vnějších membrán a druhá při určování parametrů vnitřních membrán. Na menším statistickém souboru dat se nám podařilo potvrdit závislost kvality mitochondriální sítě na podmínkách kultivace buněk. Ve stresových podmínkách, jakými je např. hypoxie, se kvalita mitochondriální sítě mění oproti kultivaci za normálních podmínek. Klíčová slova: mitochondrie, Biplane FPALM, GFP, 3D vizualizace.
|
|
|
Studium mechanismu posttranskripčního a transkripčního umlčování transgenů v buněčné linii tabáku BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
RNA interference je jedním z mechanismů, který umožňuje buňkám regulovat aktivitu genů, ovlivňovat tvorbu a udržování heterochromatinu a chránit je před invazivními nukleovými kyselinami. U rostlin je RNA interference spouštěna přítomností dvoušroubovicové RNA, která je štěpena proteinem Dicer na malé RNA o délce převážně 20-24nt. Tyto malé RNA mohou v komplexu s proteinem Argonaut na základě sekvenční komplementarity řídit štěpení mRNA, blokování translace, či modifikace chromatinu. V důsledku tak může být genová exprese umlčována buď posttranskripčně (tím že je bráněno vzniku proteinu z již vytvořené mRNA, PTGS) a nebo transkripčně (tím že je bráněno vzniku transkriptu, TGS). Záměrem této práce bylo připravení různých způsobů spouštění posttranskripčního umlčování a porovnání jejich funkčnosti a účinnosti. Dalším krokem pak byla příprava systému, který by měl umožnit sledování jednotlivých kroků přechodu posttranskripčního umlčování na umlčování transkripční. Tyto tzv. indikátorové linie by měly dovolit sledovat časování a dynamiku tohoto procesu s využitím fluorescenčních proteinů. Připravovaný systém umožní také vyhodnocení různých faktorů na průběh tohoto procesu - jedním z nich je RNA-dependentní RNA polymeráza 6, která hraje hlavní roli v samovolném spouštění PTGS. V práci je použita jako modelový...
|
|
|
The tumor immune microenvironment and its crosstalk with kallikrein-related peptidases in mammary carcinoma of a mouse model
Šlaufová, Marta ; Kašpárek, Petr (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent)
(CZ) Celosvětově je nejběžnějším typem rakoviny je rakovina prsu, jež je současně spojena s vysokou smrtností. Nalezení vhodných prognostických ukazatelů je důležitým aspektem pro bližší určení, o jaký typ rakoviny prsu se jedná a jaký průběh onemocnění lze u pacienta očekávat. Je známo, že kalikreinové proteázy jsou při rakovině prsu dysregulovány, a proto se spekuluje o jejich využití jako prognostických ukazatelů. Jejich schopnost ovlivňovat imunitní odpovědi včetně té protinádorové je též diskutována. Tento diplomový projekt využívá technologie CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) ke genetické editaci myší buněčné linie rakoviny prsu E0771. Geneticky modifikované linie E0771 jsou v projektu využívány ke studiu vzájemných interakcí mezi nádorovým mikroprostředím a kalikreinovými proteázami (KLK5, KLK7, KLK14) v C57Bl/6 myším modelu karcinomu mléčné žlázy. Diplomová práce přináší výsledky analýzy první části "in vivo" experimentů využívajících vytvořené geneticky modifikované buněčné linie v kombinaci se zavedenými myšími modely nesoucími mutace v genech pro zmíněné kalikreinové proteázy. Z předběžných výsledků tohoto diplomového projektu vyplývá, že zmíněné kalikreinové proteázy hrají roli při vývoji rakoviny prsu v použitém myším modelu a výsledky poukazují na...
|
|
|
Ubiquitin-proteasome system in studies of its inhibition and its utilization in the cell-based assay measuring viral protease activity
Fürst, Eliška ; Majerová, Taťána (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
a klíčová slova Abstrakt a klíčová slova Ubikvitin-proteazomální systém (UPS) je specificky regulovaná dráha degradace proteinů. Inhibice komponentů UPS může představovat budoucnost léčení lidských nemocí, zejména rakoviny. Modulace UPS však může být i užitečným nástrojem základního výzkumu. Práce se zabývá dvěma nezávislými, avšak metodologicky propojenými, výzkumnými cíli - prvním cílem je hledání substrátu UPS inhibitoru CBU79 a druhým cílem je vývoj buněčného reportérového systému pro sledování aktivity proteáz založený na proteinové degradaci. V první části práce jsme potvrdili dřívější poznatky mechanismu inhibice UPS. Dále jsme pomocí metabolického značení proteinů založeného na click chemii zkoumali, jak UPS inhibitor CBU79 ovlivňuje syntézu proteinů. Analyzovali jsme též cytotoxicitu inhibitoru CBU79 na různých buněčných liniích. Nakonec jsme provedli celogenomové testování pomocí technologie CRISPR/Cas9 s cílem nalezení substrátu tohoto inhibitoru. Zjistili jsme, že inhibitor CBU79 negativně ovlivňuje syntézu proteinů pravděpodobně přes signalizaci buněčné odpovědi na špatně sbalené proteiny. Pomocí tohoto testování jsme nalezli 22 možných cílů inhibitoru, které budou ověřeny v dalších pracích. Ve druhé části práce jsme využili znalosti UPS k navržení neinfekční reportérové buněčné eseje,...
|
|
|
Zobrazování fluorescenčně značených mitochondrií metodou Biplane_FPALM
Dostál, Marek ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Valenta, Jan (oponent)
Název práce: Zobrazování fluorescenčně značených mitochondrií metodou Biplane FPALM Autor: Bc. Marek Dostál Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí práce: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. Konzultanti: RNDr. Petr Ježek, DrSc. Mgr. Hana Engstová, Ph.D. Abstrakt: V této práci jsme hledali a nalezli vhodné PCFP markery pro vizualizaci vnitřní a vnější membrány mitochondrií na unikátním prototypu biplane FPALM mikroskopu. Podíleli jsme se na odlaďování měřicího softwaru za účelem 3D vizualizace mitochondriálních sítí a určení jejich parametrů. K tomuto účelu jsme vyvinuli dvě metody. Jedna je použitelná při určování parametrů vnějších membrán a druhá při určování parametrů vnitřních membrán. Na menším statistickém souboru dat se nám podařilo potvrdit závislost kvality mitochondriální sítě na podmínkách kultivace buněk. Ve stresových podmínkách, jakými je např. hypoxie, se kvalita mitochondriální sítě mění oproti kultivaci za normálních podmínek. Klíčová slova: mitochondrie, Biplane FPALM, GFP, 3D vizualizace.
|
|
|
Studium mechanismu posttranskripčního a transkripčního umlčování transgenů v buněčné linii tabáku BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
RNA interference je jedním z mechanismů, který umožňuje buňkám regulovat aktivitu genů, ovlivňovat tvorbu a udržování heterochromatinu a chránit je před invazivními nukleovými kyselinami. U rostlin je RNA interference spouštěna přítomností dvoušroubovicové RNA, která je štěpena proteinem Dicer na malé RNA o délce převážně 20-24nt. Tyto malé RNA mohou v komplexu s proteinem Argonaut na základě sekvenční komplementarity řídit štěpení mRNA, blokování translace, či modifikace chromatinu. V důsledku tak může být genová exprese umlčována buď posttranskripčně (tím že je bráněno vzniku proteinu z již vytvořené mRNA, PTGS) a nebo transkripčně (tím že je bráněno vzniku transkriptu, TGS). Záměrem této práce bylo připravení různých způsobů spouštění posttranskripčního umlčování a porovnání jejich funkčnosti a účinnosti. Dalším krokem pak byla příprava systému, který by měl umožnit sledování jednotlivých kroků přechodu posttranskripčního umlčování na umlčování transkripční. Tyto tzv. indikátorové linie by měly dovolit sledovat časování a dynamiku tohoto procesu s využitím fluorescenčních proteinů. Připravovaný systém umožní také vyhodnocení různých faktorů na průběh tohoto procesu - jedním z nich je RNA-dependentní RNA polymeráza 6, která hraje hlavní roli v samovolném spouštění PTGS. V práci je použita jako modelový...
|
|
|
Fluorescentní protein citlivý na elektrické napětí, využívající motorický protein prestin
DIVOKÝ, Karel
Cílem této práce bylo připravit sérii fluorescentně značených konstruktů na bázi prestinu, exprimovat tyto konstrukty v savčích buňkách a změřit jejich lineární dichroismus metodou dvoufotonové polarizační mikroskopie, za účelem přípravy geneticky kodované optické sondy membránového napětí. Tato práce uvádí do současných způsobů sledování elektrických vzruchů v neuronech, poskytuje informace o metodě dvoufotonové polarizační mikroskopie, popisuje naše výsledky při přípravě zmiňovaných konstruktů a shrnuje naše mikroskopická pozorování.
|
|
|
Využití vysokorozlišovací cytometrie ke studiu živých buněk
Vařecha, M. ; Amrichová, J. ; Ondřej, Vladan ; Lukášová, Emilie ; Kozubek, Stanislav ; Matula, Pa. ; Matula, Pe. ; Kozubek, Michal
Použití fluorescenčních proteinů v buněčné biologii přináší nové poznatky často odlišné od experimentů dosud prováděných pouze in situ. Tato práce představuje metodu studia živých buněk v čase ve 2D i 3D pomocí vysokorozlišovací cytometrie, popisuje také snímání obrazových dat i jejich analýzu. Jako vzorky byly použity živé buňky, jak geneticky obohacené o geny kódující fúzní fluorescenční proteiny, tak obarvené fluorescenčními sondami vhodnými pro živé buňky. Jeden z našich projektů se soustřeďuje na studium mitochondriálních a jaderných apoptotických procesů v živých buňkách a druhý projekt se zabývá studiem topographie telomer a četností telomerických asociací v různých typech lidských nádorových a zdravých buněk. V našich experimentech používáme buňky, které jsou stabilně nebo tranzientně transfekovány plazmidovou DNA kódující mitochondriální apoptotické nebo na telomery se vázající proteiny s připojenými fluorescenčními proteiny.
|
host ::
RSS.