|
|
Změny vnitrobuněčného pH kvasinek za stresových podmínek
Divín, Radek ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Změny vnitrobuněčného pH kvasinek za stresových podmínek Autor: Radek Divín Katedra / Ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. Abstrakt: Specifické hodnoty intracelulárního pH (pHi) mohou ovlivnit veškeré biochemické procesy v buňce, což je důvodem důležitosti studia změn intracelulárního pH za stresových podmínek. V práci bylo využito kvasinek Saccharomyces cerevisiae jakožto modelového organismu eukaryotních buněk. Monitorování intracelulárního pH buněk bylo prováděno metodou sychronního skenování fluorescence geneticky kódované fluorescenční sondy pHluorin, lokallizované v cytosolu buněk. Buňky byly vystaveny stresovým podmínkam vlivem chemických změn prostředí. Studovala se schopnost buněk udržet si stálou hodnotu intracelulárního pH v různě kyselých prostředích. Pozornost se věnovala také vlivu glukózy na optimalizování cytosolického pH. Práce se zabývá i změnami intracelulárního pH pod vlivem přítomnosti KCl v suspenzi. Dále se monitoroval pokles cytosolického pH buněk působením protonoforu CCCP. Vliv stresového prostředí na intracelulární pH byl studován z pohledu variací chemických látek a jejich množství v buněčné suspenzi a dále i z pohledu růstové fáze zkomaných buněk. Klíčová slova: Saccharomyces cerevisce, vnitrobuněčné pH,...
|
|
|
Zobrazování fluorescenčně značených mitochondrií metodou Biplane_FPALM
Dostál, Marek ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Valenta, Jan (oponent)
Název práce: Zobrazování fluorescenčně značených mitochondrií metodou Biplane FPALM Autor: Bc. Marek Dostál Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí práce: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. Konzultanti: RNDr. Petr Ježek, DrSc. Mgr. Hana Engstová, Ph.D. Abstrakt: V této práci jsme hledali a nalezli vhodné PCFP markery pro vizualizaci vnitřní a vnější membrány mitochondrií na unikátním prototypu biplane FPALM mikroskopu. Podíleli jsme se na odlaďování měřicího softwaru za účelem 3D vizualizace mitochondriálních sítí a určení jejich parametrů. K tomuto účelu jsme vyvinuli dvě metody. Jedna je použitelná při určování parametrů vnějších membrán a druhá při určování parametrů vnitřních membrán. Na menším statistickém souboru dat se nám podařilo potvrdit závislost kvality mitochondriální sítě na podmínkách kultivace buněk. Ve stresových podmínkách, jakými je např. hypoxie, se kvalita mitochondriální sítě mění oproti kultivaci za normálních podmínek. Klíčová slova: mitochondrie, Biplane FPALM, GFP, 3D vizualizace.
|
|
|
Bioapplications of novel nanostructured materials
Fučíková, Anna ; Valenta, Jan (vedoucí práce) ; Polívka, Tomáš (oponent) ; Plášek, Jaromír (oponent)
Název práce: Bioaplikace nových nanostrukturních materiálů Autor: Anna Fučíková Katedra: Katedra chemické fyziky a optiky, Matematicko-fyzikální fakulta Univerzity Karlovy v Praze Vedoucí doktorské práce: Doc. RNDr. Jan Valenta, Ph.D. Katedra chemické fyziky a optiky, Matematicko-fyzikální fakulta Univerzity Karlovy v Praze Abstrakt: Tato práce se zabývá vývojem nových fluorescenčních značek na bázi křemíkových nanokrystalů. Pro srovnání jsou zkoumány také nanodiamanty a komerční kvantové tečky na bázi CdSe. Křemíkové nanokrystaly jsou malé (1-4 nm) ve srovnání s ostatními testovanými nanočasticemi; připravujeme je pomocí elektro-chemického leptání v roztoku HF. Povrch Si nanokrystalů lze aktivovat různými molekulami a tím modifikovat jejich luminiscenční vlastnosti. Luminiscence má kvantovou účinnost až 30 % a je relativně fotostabilní (na rozdíl od ostatních fluorescenčních značek, které vybělují) Si nanočástice jsou poměrně stabilní v biologickém prostředí, z dlouhodobého hlediska ovšem biodegradabilní a netoxické. Pomocí mikro-spektroskopie jsme schopni pozorovat jednotlivé luminiskující Si nanokrystaly a to i uvnitř živých buněk. Studované nanodiamanty vykazují pouze slabou luminiscenci, jsou velmi stabilní v biologickém prostředí, ale neodbouratelné a při větších koncentracích značně toxické. Komerční...
|
|
|
Kompexní charakterizace buněčných suspenzí pomocí elastického rozptylu světla
Macháň, Radek ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Plášek, Jaromír (oponent)
Při experimentech s kvasinkami Saccharomyces cerevisiae, sloužícími jako modelový eukaryotní organismus je často důležité stanovit počet buněk v suspenzi. Jednou z často užívaných metod studia buněčných suspenzí je měření elastického rozptylu světla procházejícího suspenzí. Obvyklým výstupem těchto měření je úhlová závislost intenzity rozptýleného záření, která nese informaci o velikosti buněk, na kterých k rozptylu dochází. V této diplomové práci jsou studovány časové závislosti intenzity elastického rozptylu a souvislost jejich statistických vlastností s počtem rozptylových center v jednotkovém objemu. Za tím účelem byl navržen jednoduchý model popisující jak tato veličina pro monodisperzní suspenzi souvisí se závislostí směrodatné odchylky časového průběhu intenzity elastického rozptylu na střední hodnotě tohoto průběhu. K získání experimentálních dat byl zkompletován přístroj na počítačem řízené měření úhlových a časových závislostí intenzity elastického rozptylu. Měření bylo prováděno na suspenzích kvasinek Saccharomyces cerevisiae a na modelovém systému (suspenze polymerních částic o průměru 8m). Naměřená data byla interpretována v rámci navrženého modelu. Přestože suspenze kvasinek nelze považovat za monodisperzní, naměřená data byla v dobré shodě s předpověďmi navrženého modelu. To ukazuje, že efekt...
|
|
| |
|
|
Srovnání vybraných karbocyaninových fluorescenčních sond z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Mudroňová, Kateřina ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál je jednou z nejdůležitějších charakteristik živé buňky. Jednou z možností monitorování jeho změn je použití karbocyaninových fluorescenčních sond. V rámci této práce byly metodou synchronně skenované fluorescence prozkoumány vlastnosti několika sond. Z nich byly vybrány tři vhodné látky pro další experimenty jako doplněk k sondám diSC3(3) a diSC3(5), které představují standardní sondy používané v oddělení biofyziky FÚUK. Konkrétně se jedná o sondy diOC3(3), diIC1(3) a diIC2(5). Byla porovnána rychlost jejich akumulace v buňkách S. cerevisiae, na základě které jsme zjišťovali, zda jsou substráty MDR pump. Dále se tato práce zabývá otázkou ekvivalence výsledků obdržených pomocí různých fluoroforů a jejich vzájemného ovlivňování. Pro tyto účely byla zvolena dvojice sond diSC3(3) a diSC3(5), pomocí nichž byl zkoumán vliv acidifikace na membránový potenciál kvasinek S. cerevisiae. Bylo zjištěno, že informace o depolarizaci získané pomocí odlišných sond, se dobře shodují.
|
|
|
Měření vnitrobuněčné koncentrace iontů v mikroorganismech
Vodáková, Adéla ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Diplomová práce se zabývá měřením vnitrobuněčné koncentrace iontů v bakteriích Escherichia coli a kvasinkách Saccharomyces cerevisiae pomocí geneticky kódovaných fluorescenčních sond obsahujících zelený fluorescenční protein (GFP). V úvodu práce shrnuji známé poznatky o tomto proteinu a jeho spektrálních charakteristikách. Pro experimentální část práce byl vybrán senzor reagující na změny pH ve svém okolí změnou poměru intenzity fluorescence dvou pásů v excitačním spektru - poměrový pHluorin. Tato sonda byla otestována jak v bakteriálních, tak v kvasinkových buňkách. Byla sledována schopnost mikrobiálních buněk udržovat si stálou hodnotu cytosolického pH při odlišných vnějších podmínkách, jako je různé pH suspenze, přidání glukózy či KCl do suspenze. V práci je dále řešen problém odstranění příspěvku autofluorescence buněk ze signálu GFP při kalibraci a následném měření vnitrobuněčného pH. Úspěšně byla použita metoda synchronně skenované fluorescence pro potlačení nechtěných příspěvků. Při použití této metody navíc dochází k vylepšení poměru signálu k šumu a tím k zpřesnění odečítaných hodnot cytosolického pH.
|
|
| |
|
|
Deconvolution fluorescence microscopy of yeast cells
Štec, Tomáš ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent)
Název práce: Využití dekonvoluce v digitální fluorescenční mikroskopii kvasinek Autor: Tomáš Štec Katedra/ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Jarmoír Plášek, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: Fluorescenční mikroskopie představuje rychlou a levnou alternativu k po- kročilejším metodám zobrazování jako jsou konfokální a elektronová mikroskopie. Snímaný obraz je však zatížen velkou mírou zkreslení. Pomocí počítačového zpraco- vání obrazu - dekonvoluce, lze do značné míry eliminovat zkreslení obrazu, čím se umožní rekonstrukce třírozměrné podoby snímaných objektů. V této práci je pod- robně prozkoumána dekonvoluční procedura programu NIS Elements AR, která je následně aplikována na rekonstrukci třírozměrné podoby kvasinek Saccharomyces cerevisiae barvených calcofluorem, s cílem charakterizovat změny vzhledu bunkové stěny v průběhu stárnutí. S rostoucím věkem kvasinky se na povrchu objevují ne- rovnosti, ke konci života dochází i k praskání bunkové stěny. Klíčová slova: fluorescence, mikroskopie, dekonvoluce, NIS Elements AR, calcof- luor, kvasinky, bunková stěna, stárnutí
|
|
|
Srovnání fluorescenčních sond disC3(3) a diSC3(5) z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Matunová, Petra ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál představující napětí na membráně je důležitý parametr pro studium buněčných procesů. Pomocí karbocyaninových sond diS-C3(3) a diS-C3(5), označovaných společným názvem 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide, lze monitorovat změny membránového potenciálu buněk, které jsou příliš malé pro zavedení mikroelektrod. Tyto změny lze sledovat v jednotkách mV. Spektrální analýza buněčných suspenzí kvasinek S. cerevisiae s fluorescenčními sondami umožňuje stanovit koncentrace extracelulárního a intracelulárního fluorescenčního barviva, z jejichž znalosti lze určit hodnoty změn membránového potenciálu, které je možné vyvolat vnějšími podněty. Součástí práce je porovnání akumulace obou fluorescenčních sond a také experimenty zacílené na sledování vlivu vybraných látek a jejich měnících se koncentrací na volnou a vázanou složku barviva.
|
host ::
RSS.