|
|
Vývoj rychlé metody cílené mutageneze bakterie Streptococcus zooepidemicus
Černý, Zbyněk ; Španová, Alena (oponent) ; Pepeliaev,, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na vyvinutí rychlé metody cílené mutageneze genů Streptococcus zooepidemicus založené na přirozené kompetenci buněk. Na základě experimentálních dat byly vybrány geny pro deleci, které s vysokou pravděpodobností mají vliv na syntézu kyseliny hyaluronové. Byla provedena delece vybraných genů z genomové DNA jako důkaz účinnosti metody, a u rekombinantních kmenů S. zooepidemicus byly sledovány změny koncentrace prekurzorů kyseliny hyaluronové (glukuronová kyselina a N-acetylglukózamin) v čase a výsledná produkce kyseliny hyaluronové.
|
|
|
Identifikace aminokyselinových zbytků v acylované doméně RTX toxinů podílejících se na vazbě acyltransferázy
Grobarčíková, Michaela ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Černý, Ondřej (oponent)
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) a α-hemolysin (HlyA) patří do rodiny RTX toxinů, které hrají klíčovou roli v patogenezi bakterií Bordetella pertussis a Escherichia coli. Bakteriální RTX toxiny jsou produkovány gram-negativními bakteriemi a mají několik význačných společných vlastností: (1) vyžadují posttranslační aktivaci připojením řetězců mastných kyselin na dvě lysinová residua toxinu; (2) obsahují hydrofobní doménu, která v membránách cílových buněk vytváří kation- selektivní póry; (3) jsou sekretovány sekrečním systémem typu I; (4) po sekreci se stávají biologicky aktivními díky vazbě Ca2+ do opakujících se sekvencí bohatých na glycin a aspartát. CyaA přenáší adenylát-cyklázový enzym do cytozolu fagocytů a po vazbě vnitrobuněčného kalmodulinu narušuje jejich baktericidní funkce nekontrolovanou přeměnou ATP na cAMP. CyaA a HlyA také vytvářejí kation-selektivní póry, které permeabilizují membránu eukaryotických buněk. Oba toxiny se preferenčně váží na buňky nesoucí na svém povrchu β2 integriny, ale mohou interagovat se širokým spektrem eukaryotických buněk nebo i čistými lipidovými membránami. Aktivace obou toxinů z formy protoxinu probíhá modifikací za přítomnosti specifických acyltransferáz. CyaA je aktivován acyltransferázou CyaC, kdežto HlyA je aktivován acyltransferázou HlyC. Tato...
|
|
|
Preparation of mutant variants of Kingella kingae RtxA cytotoxin for membrane topology research
Lichvárová, Michaela ; Osičková, Adriana (vedoucí práce) ; Malý, Petr (oponent)
Kingella kingae je fakultativně anaerobní, β-hemolytická, gramnegativní bakterie. Bylo prokázano, že K. kingae je důležitou příčinou invazivních infekcí u malých dětí zejména ve věku od 6 do 36 měsíců. Nejčastější onemocnění způsobená bakterií K. kingae jsou septická artritida, osteomyelitida, bakteriémie a infekční endokarditida. Klíčovým faktorem virulence K. kingae je sekretovaný RtxA toxin, který patří do skupiny RTX toxinů (z angl. Repeats in ToXin). Ty se na základě buněčné specifity jejich účinku dělí do dvou kategorií, a to na hemolyziny a leukotoxiny. Široká specifita RtxA toxinu naznačuje, že daný toxin patří mezi hemolyziny. Molekuly RtxA toxinu se vkládají do membrány hostitelské buňky a vytvoří v ní póry, které jsou schopny propouštět ionty, čimž dojde k porušení iontové rovnováhy nitrobuněčného prostředí a k případné lýze buňky. Cílem předkládané bakalářské práce bylo připravit mutantní varianty cytotoxinu RtxA s lysinovými substitucemi v doméně tvořící póry pro budoucí studium membránové topologie daného toxinu s využitím metody navázaní biotinu na aminokyselinový zbytek lysinu. Pro studium topologie RtxA toxinu v membráně hostitelské buňky musí být daný toxin schopen vkládat se do buněčné membrány. Proto dalším cílem bylo stanovení biologické aktivity mutantních variant RtxA toxinu...
|
|
| |
|
|
Inženýrství mikrobiálních glykosidáz pro změnu syntetického potenciálu
Hovorková, Michaela ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Glykosidázy (EC 3.2.1.) neboli glykosidhydrolázy jsou enzymy katalyzující štěpení glykosidové vazby mezi dvěma sacharidy nebo mezi sacharidem a aglykonem. Za vhodných reakčních podmínek (zvláště snížení aktivity vody v reakční směsi) jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu též syntetizovat. Cílenou mutagenezí katalytického centra enzymů je možné potlačit nebo úplně zrušit jejich hydrolytickou aktivitu. Enzymová syntéza pomocí glykosidáz umožňuje připravit bioaktivní galaktosidy, např. ligandy galektinů. Předkládaná práce se zabývá zejména -galaktosidázou z Bacillus circulans, její rekombinantní expresí a mutagenezí. V první části práce byl mnou navržený komerčně připravený plazmid -galaktosidázy z B. circulans izoformy A použit k rekombinantní expresi v E. coli. Bylo nutné optimalizovat podmínky produkce enzymu. Jelikož jde o velký protein (189 kDa) byl použit expresní vektor pCOLD II a chladová kultivace při 15 řC. Enzym je specifický pro tvorbu glykosidové vazby β-1,4 a byl využit na syntézu komplexních tri- a tetrasacharidových ligandů, které nelze připravit s hrubým komerčním preparátem obsahujícím nežádoucí enzymové aktivity. Dále byla pomocí PCR s mutantními primery provedena cílená mutageneze katalytického nukleofilu v aktivním centru tohoto enzymu, čímž byl vytvořen mutant v pozici...
|
|
| |
|
|
Mechanism of auxin transport across plasma membrane through PIN auxin efflux carriers
Lefnar, Radek ; Petrášek, Jan (vedoucí práce) ; Nodzynski, Tomasz (oponent)
Fytohormon auxin a jeho směrovaná distribuce hraje důležitou roli v regulaci mnoha procesech během vegetativního a reproduktivního vývoje rostlin. Regulace exprese, lokalizace a aktivity proteinů PIN-formed (PIN) je důležitá pro správný transport auxinu v rostlinných pletivech. Proteiny PIN byly popsány jako hlavní přenašeče auxinu z buněk regulující směrovaný tok auxinu. Vytvořené gradienty auxinu dávají jednotlivým částem rostliny informaci o koordinaci vývoje. Predikovaná topologie a struktura proteinů PIN je dodnes nedostatečně popsána a neumožnuje správné pochopení transportního mechanismu. Experimentální analýza domén proteinů PIN může pomoci pochopit jejich úlohu ve zprostředkování transportu auxinu. Cílem této práce bylo upravit C-terminální části proteinů PIN a poodhalit tak existenci pravděpodobných funkčních domén, které jsou zodpovědné za transport auxinu. Systém transientně transformované buněčné linie tabáku Bright Yellow-2 (BY-2) byl použit pro sledování rozdílů v transportní aktivitě jednotlivých PIN proteinů. Tento přístup umožnil nepřímo sledovat množství auxinu v BY-2 buňkách pomocí DR5 reportérového systému. Tranzientně exprimované PIN proteiny navodily snížení intracelulárního auxinu, na které nepřímo poukázalo snížení signálu DR5rev::mRFP. Tranzientně exprimované modifikované...
|
|
|
Study of function and molecular architecture of fungal nitrilases applicable in biocatalysis
Veselá, Alicja Barbara ; Martínková, Ludmila (vedoucí práce) ; Macek, Tomáš (oponent) ; Teisinger, Jan (oponent)
Nitrilasy jsou enzymy katalyzující hydrolýzu nitrilů na příslušné karboxylové kyseliny a amonné ionty. Tyto enzymy mohou nalézt využití v biokatalýze a bioremediaci pro vyšší nenáročnost, bezpečnost a jednoduchost takto katalyzovaných reakcí před konvenčními metodami hydrolýzy nitrilů. V této práci byly pomocí metody prohledávání databazí vybrány sekvence hypotetických fungálních nitrilas. Jako templáty posloužily aminokyselinové sekvence fungálních nitrilas již dříve charakterizovaných v naší laboratoři. Následně byly nové syntetické geny spolu se zbylými geny z naší nitrilasové knihovny exprimovány v E. coli a poté byly porovnány jejich substrátové specifity a podobnost sekvencí. Arylacetonitrilasy z hub Arthroderma benhamiae (NitAb) a Nectria haematococca (NitNh) byly purifikovány a charakterizovány; byly stanoveny jejich substrátové specifity, kinetické parametry, pH a teplotní profily a velikost podjednotek. NitAb a NitNh spolu s dalšími rekombinantními fungálními nitrilasami byly použity pro hydrolýzu vysokých koncentrací (R,S)-mandelonitrilu v jedné dávce nebo s postupným dávkováním substrátu. Ze studovaných enzymů nitrilasa z Aspergillus niger vykázala nejlepší enantioselektivitu (e.e. pro (R)-mandlovou kyselinu až 97,6 %) a produktivitu enzymu v sušině (až 40 g gsuš -1 ). NitAb byla pouze mírně...
|
|
|
Peptidasy rodiny M16B a evoluční souvislosti mezi nimi
Hanušová, Iva ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Souhrn V teoretické části tato bakalářská práce pojednává o skupině peptidas rodiny M16B. Detailněji se zabývá strukturou a evolucí mitochondriální a hydrogenosomální ,,processingˮ peptidasy a také hypotetickou proteasou z bakterie Rickettsia prowazekii. V praktické části této práce byly prostřednictvím metody cílené mutageneze připraveny konstrukty kódující α-podjednotku hydrogenosomální ,,processingˮ peptidasy (α- HPP) se zaměněným zbytkem tryptofanu v pozici 236 za fenylalanin a tyrosin. Následně byl do konstruktu α-HPP zaveden nový reportérový zbytek tryptofanu do pozice 256, 260, 267 nebo 271 v oblasti tzv. smyčky bohaté na glycin.
|
|
|
Vývoj rychlé metody cílené mutageneze bakterie Streptococcus zooepidemicus
Černý, Zbyněk ; Španová, Alena (oponent) ; Pepeliaev,, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na vyvinutí rychlé metody cílené mutageneze genů Streptococcus zooepidemicus založené na přirozené kompetenci buněk. Na základě experimentálních dat byly vybrány geny pro deleci, které s vysokou pravděpodobností mají vliv na syntézu kyseliny hyaluronové. Byla provedena delece vybraných genů z genomové DNA jako důkaz účinnosti metody, a u rekombinantních kmenů S. zooepidemicus byly sledovány změny koncentrace prekurzorů kyseliny hyaluronové (glukuronová kyselina a N-acetylglukózamin) v čase a výsledná produkce kyseliny hyaluronové.
|
host ::
RSS.