|
|
Hypotetický protein Spr1962 jako nový substrát signalizační dráhy Ser/Thr proteinkinázy StkP a fosfatázy PhpP.
Mašková, Kateřina ; Ulrych, Aleš (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Hypotetický protein Spr1962 jako nový substrát signalizační dráhy Ser/Thr proteinkinázy StkP a fosfatázy PhpP Extracelulární lidský patogen Streptococcus pneumoniae kóduje ve svém genomu pouze jednu serin/threoninovou proteinkinázu eukaryotního typu (StkP) a příslušnou PP2C fosfatázu (PhpP), proto je unikátním modelovým organismem pro studium signalizačních drah u bakterií. Dosud bylo identifikováno a charakterizováno několik substrátů těchto signalizačních proteinů, mezi které patří například proteiny DivIVA, KhpB, FtsA, FtsZ, MacP, GlmM, GpsB, ComE a další. Jedná se o proteiny, které se účasní různých buněčných procesů, včetně buněčného dělení a syntézy peptidoglykanu. Pomocí globální fosfoproteomové studie založené na LC-MS analýze bylo zjištěno, že jedním z identifikovaných proteinů je hypotetický protein Spr1962, jehož fosforylace byla detekována pouze v hyperfosforylovaném kmeni s odstraněnou fosfatázou PhpP. Cílem této práce byla charakterizace nového substrátu Spr1962 a objasnění jeho možné funkce. Vzhledem k významné strukturní podobnosti s flotilinovým proteinem bakterie Bacillus subtilis FloT bylo navrženo, že by se mohlo jednat o protein s analogickou funkcí u pneumokoka. Bylo zjištěno, že odstranění tohoto genu způsobuje fenotyp zvětšených buněk na různých genetických pozadích. Sledováním...
|
|
|
Optimalizace metody izotermální amplifikace zprostředkované smyčkou pro testování infekce způsobené bakterií Streptococcus pneumoniae
Friček, Matúš ; Jeřábek, Petr (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Streptococcus pneumoniae je grampozitivní patogenní bakterie. Podle světové zdravotnické organizace je tato bakterie nejčastěji se vyskytujícím mikrobiálním zdrojem onemocnění jako je pneumonie či meningitida u dětí. Standardem pro detekci patogenů je v současnosti polymerázová řetězová reakce. V posledních desetiletích došlo k rozvoji amplifikačních metod, mezi které se řadí také izotermální amplifikace zprostředkovaná smyčkou, která by díky své nízké instrumentální náročnosti i jednoduchému způsobu vyhodnocení mohla představovat vhodnou alternativu pro detekci patogenů. Zavedení této metody do klinické praxe je komplikováno častým výskytem falešné pozitivity u vzorků neobsahujících příslušnou DNA. V rámci předkládané bakalářské práce bylo proto velmi důležité identifikovat a odstranit hlavní zdroj kontaminace, jimž se na základě dosažených výsledků zdají být produkty předchozích reakcí. V současnosti se pro detekci bakterie S. pneumoniae metodou PCR nejčastěji využívají geny lytA a piaB. V dostupných zdrojích není zmínka o využití genu piaB pro LAMP detekci bakterie S. pneumoniae. Předmětem této práce bylo navržení optimální sady LAMP "primerů" pro detekci tohoto genu. V rámci optimalizace metody byly LAMP experimenty prováděny s využitím různých způsobů vizualizace produktů reakce, konkrétně...
|
|
|
Studium esenciality genu glmM kodujiciho fosfoglukosaminmutasu Streptococcus pneumoniae.
Krupička, Jiří ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Fosfoglukozaminmutáza (GlmM) představuje enzym hrající roli v biosyntéze buněčné stěny bakterií. Hlavním záměrem této diplomové práce bylo zjistit, zda je gen glmM esenciální pro životaschopnost Streptococcus pneumoniae. Za tímto účelem jsme vytvořili merodiploidní kmen obsahující dvě kopie glmM - nativní gen a jeho ektopickou kopii pod kontrolou inducibilního zinkového promotoru. Delecí nativního genu glmM jsme vytvořili mutantní kmen, u něhož jsme analyzovali životaschopnost a fenotyp v médiu s různými koncentracemi zinečnatých iontů, induktoru exprese ektopické kopie glmM. Zjistili jsme, že životaschopnost mutantního kmene je striktně závislá na koncentraci induktoru v médiu a úbytek GlmM se u buněk projevuje výraznými morfologickými defekty a sklonem k lyzi. Prokázali jsme, že následné vyrovnání koncentrace induktoru v médiu na koncentraci odpovídající kontrolnímu vzorku komplementuje projevy úbytku GlmM. Tyto výsledky dokazují esencialitu glmM pro životaschopnost S. pneumoniae. Dále jsme analyzovali, zda je pro funkčnost GlmM esenciální fosforylace na klíčových aminokyselinových zbytcích S99 a S101. Cílenou mutagenezí jsme připravili čtyři varianty plazmidů nesoucích glmM kódující záměny serinových zbytků za alanin nebo kyselinu glutamovou a transformovali je za vzniku čtyř merodiploidních kmenů, v...
|
|
|
Tvorba biofilmu u Streptococcus pneumoniae
Jarošová, Václava ; Petráčková, Denisa (vedoucí práce) ; Matyska Lišková, Petra (oponent)
Biofilm je strukturované společenství buněk adherovaných k povrchu či k sobě navzájem a obklopených extracelulární matrix. Tvorba biofilmu probíhá v několika krocích od jednotlivých buněk adherovaných k povrchu až po mikrokolonie propojené kanály. Přítomnost biofilmu na zdravotnických materiálech a obtíže při léčení bakteriálních infekcí spojených s výskytem biofilmu jsou stále aktuálním problémem, kvůli zvýšené rezistenci těchto bakterií k antimikrobiálním látkám. V centru našeho zájmu je bakterie tvořící biofilm Streptococcus pneumoniae. Jedná se o podmíněně patogenní bakterii, která kolonizuje horní cesty dýchací a způsobuje řadu nemocí. Biofilmy tvořené bakterií S. pneumoniae vykazují zvýšenou rezistenci k antibiotikům, a proto jsou v posledních letech studovány alternativní antimikrobiální látky. Ke studiu biofilmu jsou používané kultivační systémy otevřené i uzavřené. K otevřeným patří "flow cell" a biofilmové reaktory, mezi uzavřené řadíme "Calgary biofilm device" a Christensenovu metodu v mikrotitračních destičkách.
|
|
|
Funkční studie potenciální nukleotidázy kódované genem spr1057 Streptococcus pneumoniae, homologa proteinu YjjG E. coli
Vacková, Zuzana ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
ČESKÝ ABSTRAKT Funkční studie potenciální nukleotidasy kódované genem spr1057 v Streptococcus pneumoniae, homologa proteinu YjjG Escherichia coli. Bakteriální buňky jsou neustále vystavovány nespočetným toxickým látkám, ať už z vnějšího prostředí či vedlejším produktům jejich vlastního metabolismu. Z těchto důvodů jsou bakteriální buňky vybaveny několika mechanismy, které tyto toxické látky eliminují. Jedná se hlavně o: blokaci adsorbce, transport specifickými transportéry a specifickou inaktivaci těchto látek enzymy. Zvláštní skupinu těchto toxických látek jsou modifikované nukleotidy, které mohou v bakteriální buňce přímo zabránit replikaci DNA, nebo způsobit mutace. Enzymy rozpoznávající tyto modifikované deriváty se označují jako "house-cleaning" "úklidové" nukleotidfosfatasy, působí na modifikované potenciálně mutagenní nukleotidy a zabraňují tak jejich včlenění do DNA či RNA. Část z těchto "úklidových" enzymů se řadí do skupiny haloacid dehalogenas (haloacid dehalogenase-like hydrolase superfamily), nalezených u mnoha bakteriálních druhů. Tato diplomová práce je zaměřena na funkční studii hypotetického proteinu Spr1057 Streptococcus pneumoniae o doposud neznámé funkci. Na základě sekvenčního srovnání vyplynulo, že Spr1057 má významnou podobnost s proteinem YjjG Escherichia coli. Analýza transkriptomu...
|
|
|
Spr0334, nový protein buněčného dělení u Streptococcus pneumoniae.
Štekerová, Nela ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Spr0334, nový protein buněčného dělení u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae je významný lidský patogen. Tato bakterie kóduje ve svém genomu jediný gen pro serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotního typu nazvanou StkP. StkP reguluje mnoho fyziologických procesů, jako např. patogenezi, kompetenci pro genetickou transformaci, rezistenci k různým druhům stresů a rezistenci k antibiotikům. Rovněž ovlivňuje transkripci celé řady genů účastnících se biosyntézy buněčné stěny, pyrimidinového metabolizmu, oprav DNA a příjmu železa. Současné studie ukázaly, že StkP je lokalizována v buněčné přepážce a významným způsobem reguluje buněčné dělení a morfologii. Mezi její substráty patří mimo jiné proteiny buněčného dělení DivIVA, FtsZ a FtsA. Porovnáním fosfoproteomových map divokého kmene a kmene ΔstkP S. pneumoniae bylo prokázáno, že StkP in vivo fosforyluje několik substrátů, mezi něž patří i membránový protein Spr0334. Hmotnostní spektrometrií byla určena místa fosforylace proteinu Spr0334, a to threonin 67 a threonin 78. Dále bylo zjištěno, že je protein Spr0334 lokalizován v buněčné přepážce, což vedlo k hypotéze, že by mohl být dalším proteinem buněčného dělení u S. pneumoniae. Hlavním záměrem této diplomové práce bylo přiblížit funkci neznámého proteinu Spr0334 u S. pneumoniae a zjistit vliv...
|
|
|
Studium unikátní signální dráhy Ser/Thr proteinkinázy StkP a fosfatázy PhpP u Streptococcus pneumoniae
Keil, Jan ; Ulrych, Aleš (vedoucí práce) ; Bobková, Šárka (oponent)
Významný lidský patogen Streptococcus pneumoniae je jedinečným modelem pro studium serin/threoninových proteinkináz eukaryotního typu a jejich příslušných fosfatáz u bakterií, jelikož kóduje pouze jediný signalizační pár složený z proteinkinázy StkP a fosfatázy PhpP. Tento signalizační pár hraje úlohu v řadě buněčných procesů zejména pak v syntéze buněčné stěny a buněčného dělení. Signalizační pár StkP/PhpP nejspíše reguluje složitou síť signalizačních kaskád reverzní fosforylací několika substrátů, z nichž je charakterizována pouze část. Nedávno bylo pomocí MS analýzy identifikováno kolem 90 fosfopeptidů, které jsou potenciálními substráty kinázy StkP a fosfatázy PhpP. Cílem této diplomové práce byla charakterizace předpokládaného nového substrátu Spr0929 a jeho vlivu na fyziologii pneumokoka. Zkoumána byla morfologie buněk kmenů s odstraněným genem spr0929 na různých genetických pozadích pneumokoka. Bylo zjištěno, že vliv odstranění tohoto genu na morfologii buněk je kmenově specifický. Porovnáván byl též růst buněk postrádajících gen spr0929 s divokým typem, a to za různých fyziologických podmínek. Jelikož protein Spr0929 obsahuje nukleoid-asociovanou doménu NdpA, určení jeho lokalizace v buňce byla též jedním z důležitých cílů práce. Translační fúzí s fluorescenční značkou GFP byla odhalena...
|
|
|
Regulace penicilin vazebného proteinu Pbp2a u Streptococcus pneumoniae
Kubeša, Bohumil ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Pospíšil, Jiří (oponent)
Regulace penicilin vazebného proteinu Pbp2a u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae je extracelulární lidský patogen, který ve svém genomu kóduje unikátní Ser/Thr proteinkinasu eukaryotického typu StkP. Tento enzym se prostřednictvím fosforylace svých substrátu podílí zejména na regulaci buněčného dělení a syntéze buněčné stěny. Transmembránový protein MacP byl identifikován jako substrát proteinkinasy StkP. Jedná se o aktivátor penicilin vazebného proteinu PBP2a, který se svou transpeptidasovou a transglykosylasovou aktivitou podílí na syntéze peptidoglykanu. Zjistili jsme, že MacP je fosforylován proteinkinasou StkP v pozicích T32 a T56. Potvrdili jsme, že MacP a PBP2a vzájemně interagují a fosfoablativní ani fosfomimetické mutace majoritních fosforylovaných zbytků proteinu MacP nemají vliv na interakci s PBP2a a neovlivňují zásadně ani funkci MacP in vivo. Dále se nám podařilo dokázat, že delece macP je synteticky letální s delecí pbp1a, čímž jsme potvrdili, že je MacP aktivátorem proteinu PBP2a. MacP je lokalizován v buněčné přepážce a interaguje s řadou proteinů buněčného dělení S. pneumoniae. Klíčová slova: Streptococcus pneumoniae, buněčné dělení, MacP, PBP2a, fosforylace
|
|
|
Porovnání různých molekulárně-biologických přístupů pro detekci přítomnosti DNA patogenní bakterie Streptococcus pneumoniae
Čížová, Kateřina ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Bakterie Streptococcus pneumoniae je v současnosti jedním ze závažných patogenních mikroorganismů ohrožujících děti do věku 5 let, zejména v rozvojových zemí. Nástrojem v boji s tímto patogenním mikroorganismem je vhodná metoda detekce. Předkládaná bakalářská práce se zabývá porovnáním molekulárně-biologických metod detekce bakterie Streptococcus pneumoniae, konkrétně kvantitativní polymerasovou řetězovou reakcí a izotermální amplifikací DNA pomocí smyček. Byl zaveden standardní protokol pro detekci bakterie Streptococcus pneumoniae pomocí "zlatého standardu" molekulární diagnostiky, tedy kvantitativní polymerasovou řetězovou reakcí. Alternativou detekce pomocí kvantitativní polymerasové řetězové reakce, bylo praktické zavedení metody izotermální amplifikace DNA pomocí smyček využívající publikované "primery". S cílem rozšířit diagnostické okno metody izotermální amplifikace pomocí smyček, a bojovat s falešnou pozitivitou negativní kontroly, byla navržena a testována sada nových "primerů" pro detekci bakterie Streptococcus pneumoniae. Výsledkem práce byl nový, rychlý a spolehlivý protokol detekce bakterie Streptococcus pneumoniae, využívající kombinaci nově navržených a publikovaných "primerů". Novým protokolem detekce jsme optimalizovali diagnostické okno a metoda během několika minut bezpečně...
|
|
|
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
Holečková, Nela
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumonaie je nejen významný lidský patogen, ale také vhodný modelový organismus ke zkoumání buněčného dělení u ovoidních bakterií. Tato bakterie postrádá oba systémy výběru místa buněčného dělení Min a NO, a tedy mechanismus, jakým určuje místo, ve kterém nastane buněčné dělení, je neznámý. Navíc ve svém genomu kóduje jedinou serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotického typu nazývanou StkP a jedinou serin/threoninovou proteinfosfatasu PP2C typu nazývanou PhpP. StkP je jedním z hlavních regulátorů buněčného dělení a pravděpodobně ovlivňuje průběh buněčného dělení i fosforylací svých substrátů, mezi které mimo jiné patří proteiny buněčného dělení FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR a LocZ/MapZ. První projekt této disertační práce se zabývá určením funkce proteinu LocZ v rámci buněčného dělení. Souhrnně, locZ sice není esenciální, ale účastní se procesu výběru místa dělení u S. pneumoniae a naše výsledky napovídají, že patří mezi pozitivní regulátory umístění Z-kruhu. Buňky s deplecí LocZ jsou schopny tvořit Z-kruh, ale ten je prostorově špatně umístěn, což má za následek defekty v buněčném dělení, deformity buněčného tvaru a tvorbu nerovnoměrně rozdělených dceřiných buněk, které občas neobsahují žádnou DNA. LocZ má...
|
host ::
RSS.