|
|
Analýza bakteriálních buněk pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie
Müllerová, Lucie ; Mravec, Filip (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi analýzy viability a obsahu polyhydroxyalkanoátů (PHA) bakteriálních buněk, a to pomocí průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. V části věnující se cytometrické analýze bakteriálních buněk byla otestována řada viabilních fluorescenčních sond, ale prakticky se osvědčily pouze dva systémy – propidium iodid a komerční BacLightTM kit, který vykazoval o něco vyšší přesnost stanovení viabilitně bakteriální kultury. Dále byla využita akridinová oranž k analýze fyziologického stavu mikrobiální kultury a dvě hydrofobní sondy, Nilská červeň a BODIPY 493/503, k analýze obsahu PHA v bakteriálních buňkách. Především sonda BODIPY 493/505 se zdá být velmi zajímavá, protože nevyžaduje permeabilizaci buněčných obalů a díky svým spektrálním vlastnostem je plně kompatibilní s propidium iodidem. Tato skutečnost otevírá možnost simultánní analýzy viability bakteriálních kultur a obsahu PHA. V části vyhodnocování mikroskopických výsledků bylo prezentováno několik fluoroforů. Bylo zjištěno, že koncentrace fluoroforů využívaná pro cytometrické analýzy je pro mikroskopii příliš vysoká. SYTO9 svítící převážně v zeleném kanále měla určitý fluorescenční signál i v červeném kanále. Vzorky obarvené BODIPY 493/503 vykazovaly vysoké intenzity fluorescence při koncentraci barviva 10 . Zároveň byly jak u obou kmenů naměřeny záporné amplitudy intenzity fluorescence, výraznější byla u C. necator H16. U tohoto kmene byl překvapivý objev vysoké koncentrace barviva především na povrchu granulí PHB, kde byla zároveň téměř nulová anisotropie barviva (volná otáčivost sondy).
|
|
|
Studium odolnosti bakterií vůči vybraným stresovým faktorům
Miléřová, Miluše ; Samek,, Ota (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem diplomové práce bylo studium vlivu akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA) na odolnost bakterií vůči vybraným stresovým faktorům. V teoretické části byla zpracována literární rešerše zabývající se vybranými stresovými faktory, polyhydroxyalkanoáty a zapojením polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi. V experimentální části byla použita bakterie Cupriavidus necator H16 a její mutantní kmen Cupriavidus necator H16/PHB-4 neschopný akumulace polyhydroxybutyrátu (PHB). Byla testována odolnost výše zmíněných bakteriálních kmenů vůči teplotnímu a osmotickému stresu. Na základě výsledků experimentu, kdy byly bakterie vystaveny 3 různým koncentracím NaCl (50, 100 a 200 g/l), bylo zjištěno, že PHB akumulující kmen vykazuje vyšší odolnost vůči hyperosmotickému stresu než jeho PHB neprodukující mutant. Ramanovou spektroskopií bylo dokázáno, že v hyperosmotickém prostředí došlo ke krystalizaci intracelulárních PHB granulí. Transmisní elektronovou mikroskopií bylo zjištěno, že kmen Cupriavidus necator H16/PHB-4 podléhá při hyperosmotickém stresu plazmolýze. U kmene Cupriavidus necator H16 dochází vlivem hyperosmotického stresu k agregaci intracelulárních PHB granulí, ale k plazmolýze nedochází nebo je výrazně méně intenzivní.
|
|
|
Controlled Production and Degradation of Selected Biomaterials
Obruča, Stanislav ; Demnerová, Kateřina (oponent) ; Vávrová, Milada (oponent) ; Němec, Miroslav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Proposed dissertation thesis is aimed at the study of production and degradation of polymeric materials using microorganisms. The main attention is given to polyesters of bacterial origin - polyhydroxyalkanoates. These materials are accumulated by a wide variety of bacterial strains which use polyhydroxyalkanoates as a storage of carbon, energy and reducing power. Thanks to their mechanical properties, that are similar to those of traditional synthetic plastics such as polyethelene or polypropylene, and thanks to their biodegradability, polyhydroxyalkanoates are considered to be environmental-friendly alternative to traditional plastics of petrochemical origin. Thus, polyhydroxyalkanoates have many potential applications in industry, agriculture as well as in medicine. Important part of this thesis is focused on production of polyhydroxyalknotes from waste substrates coming from food industry. Among tested substrates was waste cheese whey or waste plant edible oils of different origin. Utilization of cheap waste substrates for polyhydroxyalkanoates production could facilitate economically feasible process of large scale production of polyhydroxyalkanoates. According to the results presented in this thesis, waste oils are very promising substrates for biotechnological production of polyhydroxyalkanoates. Next part of the thesis deals with involvement of polyhydroxyalkanoates into stress response of bacteria. It was observed, that exposition of bacterial culture to controlled dose of ethanol or hydrogen peroxide resulted in significantly enhanced yields (abut 30 %). After stress factors application, particular metabolic pathways involved in stress response were activated in order to endure stress conditions. Subsequently, NAD(P)H/NAD(P)+ ratio increased and, thus, Krebs cycle was partially inhibited whereas polyhydroxyalkanoates synthetic pathway was activated. Moreover, application of stress factors increased molecular weights of polymers. Therefore, strategy based on application of controlled dose of stress not only enhanced polymer yields, but, moreover, improved properties of materials. The last part of thesis describes the investigation of biodegradation of polyurethane elastomeric films modified by various biopolymers in presence of mixed thermophillic culture as a model of natural bacterial consortium. The presence of materials in cultivation medium resulted in delayed but intensive growth of bacterial culture. The unusually long lag-phase was caused by release of un-reacted polyether polyol and tin catalyst from materials. The main part of material degradation was caused by abiotic degradation of elastomeric films, nevertheless, also bacterial culture slightly contributed to material decomposition. The measure of biotic degradation strongly depended on type of used modification agent. The highest tendency to undergo biotic degradation was observed for elastomeric film modified by acetylated cellulose.
|
|
|
Utilization of lignocellulose materials for biotechnological production of polyhydroxyalkanoates
Kučera, Dan ; Márová, Ivana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This diploma thesis describes the possibilities of utilization of lignocellulosic material as a renewable resource to produce polyhydroxyalkanoates (PHA) by biotechnological methods. The theoretical part focuses on the characterization of plant waste biomass, its enzymatic saccharification and the possibilities of production and isolation of hydrolytic enzymes. Furthermore, the literature review deals with bacterial PHA production and the possibility to utilize lignocellulosic biomass for their production. In the experimental part, waste substrates hydrolyzed by chemical and enzymatic pathways were selected. Apple, wine and rapeseed pomace and spent coffee grounds were used as waste substrates. Burkholderia cepacia was employed for PHA production from obtained hydrolysates. Apple pomace appears to be the most promising substrate. It turned out that the selected bacterial strain is capable to utilize waste substrates even without previous treatment. The supernatant exhibited following activities after cultivation: protease, lipase (0.47 nmol/(mL•min)), cellulase for CMC (6.05 nmol/(mL•min)) and filter paper (4.63 nmol/(mL•min)) and xylanase (1.71 nmol/(mL•min)). These enzymes can represent an interesting byproduct PHA production from agricultural waste materials. The work assesses also the effect of time course of cultivation and method of hydrolysis on the resulting PHA production and enzymatic activity of industrially interesting enzymes.
|
|
|
Posouzení vybraných parametrů na biotechnologickou produkci polyhydroxyalkanoátů
Eremka, Libor ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem práce je studium mikrobiální produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA). V teoretické části je zpracován stručný přehled produkce PHA pomocí mikroorganismů a transgenních rostlin. Pro laboratorní práci byla využita průmyslově užívaná bakterie Cupriavidus necator H16. Různé odpadní oleje byly použity jako jediných zdroj uhlíku a energie. Pro zlepšení materiálových vlastností PHA byly použity prekurzory 1-propanol a propionát sodný, které byly inkorporovány do polymeru ve formě 3-hydroxyvalerátu (3HV). Hlavní část experimentální práce byla zaměřena na studium vlivu aerace (koncentrace rozpuštěného kyslíku v médiu) na tvorbu biomasy, na ovlivnění vybraných metabolických drah a na akumulaci PHA. Dle získaných experimentálních výsledků byla potvrzena závislost mezi aerací a monomerním složením PHA. Dále byl potvrzen fakt, že vyšší koncentrace kyslíku podporuje bakteriální růst a ovlivňuje intenzitu akumulace PHA v buňkách. NADPH má podstatný vliv na osud acetyl-CoA v metabolismu, vyšší vnitrobuněčná koncentrace NADPH inhibuje citrátový cyklus a zvyšuje akumulaci PHA v buňkách. Z toho důvodu byla vyhodnocena enzymová aktivita vybraných intracelulárních enzymů v závislosti na intenzitě aerace, včetně enzymů schopných generovat NADPH.
|
|
|
Controlled biotechnological production of polyhydroxyalkanoates
Šnajdar, Ondřej ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This diploma thesis deals with production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by bacterial strain Cupriavidus necator H16. Goal of this work was preparation, selection and characterization of mutant strains overproducing PHA. Theoretical focuses on the most important PHA, bacteria Cupriavidus necator and mutagenesis techniques. In practical part mutant strains were prepared through physical and chemical mutagenesis. Mutant strains overproducing PHA were selected by cultivation in mineral medium with oil. For further study, 4 mutant strains overproducing PHA were selected. These mutants were biochemically characterized. Specific activities of several intracellular enzymes including enzymes involved in PHA biosynthesis were measured. Resistance of mutants against oxidative stress was measured as well. Mutant strains overproducing PHA revealed higher enzymatic activities of NADPH producing enzymes. Generally, NADPH is one of the substrates influencing flux of acetyl-CoA throughout the metabolism; higher intracellular concentration of NADPH partially inhibits TCA cycle and activates accumulation of PHA. Therefore, activities of acetoacetyl-CoA reductase and PHB synthase, enzymes directly involved in PHA synthesis were higher as compared to wild strain as well as molecular weight of produced materials. It can be concluded that biotechnologically perspective mutagens capable of PHA overproduction can be prepared by application of chemical and physical mutagens.
|
|
|
Biotechnologická produkce polyhydroxyalkanoátů s využitím odpadů kávového průmyslu
Vašíčková, Monika ; Benešová, Pavla (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá produkcí polyhydroxyalkanoátů (PHA) kmeny bakterií Burkholderia cepacia a Burkholderia sacchari. Produkce PHA byla studována s využitím různými způsoby předupravené a hydrolyzované kávové sedliny. V rámci práce byla porovnána standardní metoda hydrolýzy kávové sedliny zředěnou minerální kyselinou a následnou enzymatickou hydrolýzou provedenou pouze pomocí enzymů. Vzniklé hydrolyzáty byly analyzovány se zaměřením na obsahu redukujících sacharidů a výtěžnost hydrolýzy. Z výsledků vyplývá, že nejlepší předpoklady pro produkci PHA měly vzorky vyprodukované bakterií Burkholderia cepacia a to v kultivačním médiu připraveném hydrolýzou kávové sedliny, která byla vystavena extrakci 60% ethanolem. Výtěžek biomasy v tomto médiu byl 3,553 g/l s procentuálním obsahem PHA 32,472% v biomase. Vzniklý PHA obsahoval 6,09% 3-hydroxyvalerátu. V rámci dalšího experimentu byl ověřen alternativní přístup hydrolýzy kávové sedliny, kde byly použity komerčně dostupné enzymy celuláza, hemiceluláza a extracelulární enzymatický koktejl vyprodukovaný plísní schopnou utilizovat kávovou sedlinu. Hemiceluláza se ukázala být nejefektivnějším hydrolytickým enzymem a proto nejvyšší obsah biomasy 5,708 g/l se také nacházel v médiu připraveného hemicelulázou katalyzovanou hydrolýzou kávové sedliny, která byla extrahovaná 60% ethanolem. Nedocházelo zde k produkci kopolymeru P(HB-co-HV), ale jen polymeru PHB, což bylo nejspíše způsobeno tím, že v průběhu enzymatické hydrolýzy nevznikala kyselina levulinová ani žádný jiný potenciální prekurzor 3HV.
|
|
|
Zapojení polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi bakterií v pozdní stacionární fázi
Šuráňová, Zuzana ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem bakalářské práce bylo studium zapojení polyhydroxyalkanoátů (PHA) do stresové odpovědi bakterií v pozdní stacionární fázi. Pro tento experiment byly vybrány bakterie Cupriavidus necator H16 (schopná produkovat PHA) a Cupriavidus necator H16/PHB-4 (neschopná produkovat PHA). V teoretické části byla zpracována literární rešerše zabývající se polyhydroxyalkanoáty a stresovou odpovědí bakterií. V praktické části bylo studováno zapojení polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi bakterií v pozdní stacionární fázi vůči vybraným stresovým faktorům. Byla studována odolnost bakterií vůči různým stresovým podmínkám. V průběhu dlouhodobých kultivací byla posouzena viabilita a distribuce PHA v bakteriálních buňkách pomocí průtokové cytometrie a obsah PHA v biomase byl analyzován pomocí plynové chromatografie s FID detektorem. Na základě výsledků získaných v této práci bylo zjištěno, že bakterie PHA akumulující Cupriavidus necator H16 lépe odolává limitaci uhlíkatým zdrojem a také vykazuje vyšší odolnost vůči některým stresovým faktorům ve stacionární fázi než PHA neprodukující bakterie Cupriavidus necator H16/PHB-4, jako je aplikace ethanolu a zmražení.
|
|
|
Studium zapojení polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi mikroorganismů
Kučera, Dan ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem práce bylo studium zapojení polyhydroxyalkonoátů (PHA) do stresové odpovědi bakterií. Teoretická část bakalářské práce se zabývá možností stanovení viability mikroorganismů s využitím moderních technik, především průtokové cytometrie. Dále pak byla zpracována rešerše zaměřená na vybrané stresové faktory a zapojení PHA do stresové odpovědi. V experimentální části práce byla posuzována stresová odpověď v souvislosti se schopností akumulovat PHA. Tomuto experimentu posloužila bakterie Cupravidus necator. Schopnost akumulace PHA v pozdější fázi růstové křivky navyšuje odolnost vůči ethanolu, vysoké teplotě a mražení. Naopak nižší odolnost jevil kmen produkující PHA při působení anorganickými kyselinami a zásadami. Důvodem může být odlišná morfologie PHA produkujících buněk. Dílčím cílem bylo i studium možnosti barvení živých buněk akumulujících PHA pomocí Nilské červeně. Studium ukázalo, že barvivo penetruje do živých buněk při teplotě zvýšené na 40-45 °C. Tato teplota není pro buňky letální a intenzita barvení je dostatečná k odlišení PHA produkujících buněk pomocí průtokové cytometrie, což může mít využití při selekci průmyslových producentů PHA.
|
|
|
Produkce mcl-PHA pomocí vybraných bakterií
Eremka, Libor ; Němcová, Andrea (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Cílem práce bylo studium možnosti mikrobiální produkce polyhydroxyalkanoátů se střední délkou řetězce (mcl-PHA, „medium-chain-lenght PHA“). Pro produkci byly využity bakterie Pseudomonas putida a Pseudomonas aeruginosa. Teoretická část bakalářské práce se zabývá biosyntézou polyhydroxyalkanoátů, jejich materiálovými vlastnostmi a mikrobiálními producenty. V experimentální části byly vybrané bakterie kultivovány na různých substrátech za účelem vyhodnocení jejich schopnosti využívat různé uhlíkaté zdroje a akumulovat mcl-PHA. Množství a složení akumulovaných mcl-PHA v biomase bylo analyzováno pomocí plynové chromatografie s plameně ionizačním detektorem. Kmen Pseudomonas putida akumuluje více mcl-PHA v médiu obsahující řepkový olej ve srovnání s kmenem Pseudomonas aeruginosa. P. putida akumuluje 2,11% mcl-PHA při kultivaci na glycerolovém médiu.
|
host ::
RSS.