|
| |
|
|
Mutageneze a exprese proteinu NKp80, aktivačního receptoru lidských lymfocytů
Pazderová, Kristýna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Předmětem této práce je receptor NKp80, také známý jako KLRF1 (z angl. killer cell lectin-like subfamily F, member 1). Je to aktivační receptor tvořící homodimery na povrchu NK buněk. Váže se na ligand AICL, který se přirozeně nachází na myeloidních buňkách. Pokud dojde k výraznému navýšení exprese ligandu AICL, např. na nádorových buňkách, stává se buňka terčem pro NK buňky, které exprimují receptor NKp80. Komplex NKp80:AICL je potenciálním cílem imunoterapeutické léčby myeloidní leukémie. Cílem práce byla produkce a purifikace extracelulární domény receptoru NKp80 a jejích variant, kde v její části tzv. "stalk" oblasti byly jednotlivé cysteiny nahrazeny seriny. Pomocí zavedených mutací zde byl sledován vliv na tvorbu homodimerů. Proteiny byly produkovány za použití stabilně transfekovaných linií buněk HEK293S GnTI-. Celkem bylo produkováno sedm mutantů se všemi možnými kombinacemi mutací tří cysteinů "stalk" oblasti. Proteiny pak byly analyzovány pomocí analytické gelové permeační chromatografie, diferenční skenovací fluorimetrie, a nakonec byla pomocí deglykosylace ověřena přítomnost více glykosylačních forem receptoru NKp80. Z výsledků je zřejmé, že u žádné varianty receptoru NKp80 nedochází ke tvorbě kovalentních homodimerů, ale z hodnoty elučního objemu proteinu můžeme předpokládat, že v...
|
|
|
Strukturní studium potkaního NK buněčného receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
NK buňky vykazují unikátní schopnost rozeznávat a způsobit smrt nádorových, či virem infikovaných buněk bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je regulována vyváženými signály indukovanými aktivačními a inhibičními povrchovými receptory při interakci s ligandy cílové buňky. To může být ilustrováno na potkaním receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb, které hrají mimo jiné zásadní roli v odpovědi NK buněk na infekci potkaním cytomegalovirem (RCMV). Během infekce RCMV cílová buňka snižuje expresi ligandu Clrb a tím snižuje inhibiční signál přenášený skrze NKR-P1B do NK buňky, to v ideálním případě vede k aktivaci NK buňky a lyzi infikované buňky. Nicméně, RCMV obsahuje gen pro falešný povrchový receptor - RCTL, který napodobuje Clrb, a tak napomáhá úniku před imunitní odpovědí NK buněk. Zatímco tato úniková strategie byla zaznamenána v kmeni potkanů WAG, ukázalo se, že NKR-P1B homolog z potkaního kmene SD váže pouze Clrb a nerozeznává RCTL. Díky tomu je SD kmen méně citlivý k infekci RCMV. Tato práce si klade za cíl poodhalit molekulární základ NKR-P1B:Clrb receptor- ligandového rozeznávání, přičemž vychází z našich dřívějších úspěšných výsledků získaných pro lidský NKR-P1:LLT1 receptor-ligandový pár. Ukázalo se, že pro následnou krystalizaci NK buněčných receptorů a jejich ligandů je...
|
|
|
Produkce a purifikace rekombinantního receptoru Clrb
Prokopová, Tereza ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Přirozeně cytotoxické buňky hrají zásadní roli v nespecifické imunitě. I bez antigenně specifických receptorů na svém povrchu jsou schopny výkonné obranyschopnosti. Rozeznávají jak "cizí", tak tělu vlastní molekuly, respektive absenci tělu vlastních molekul, konkrétně MHC glykoproteinů I. třídy, na površích cílových buněk. Jsou schopny rozeznat virem napadené a nádorové buňky v organismu. Pokud dojde ke kontaktu s buňkou nesoucí abnormálně málo MHC glykoproteinů I. třídy, je to pro přirozenou zabíječskou buňku ("natural killer cell", NKC) signál, že tato buňka je například napadená virem. I bez předchozí stimulace, proliferace a diferenciace NK buňka spouští apoptózu cílové buňky. Je také schopna spustit zánětlivé reakce produkcí chemokinů a cytokinů. Výsledná reakce je vždy souhrou aktivačních a inhibičních signálů, které buňka přijímá ze svého okolí. Nejnovější výzkumy ukazují, že cílená modulace NK buněk vede ke zmírnění komplikací při transplantaci kostní dřeně. Zároveň mají potenciál v imunoterapiích, např. při léčbě autoimunitních onemocnění. Z tohoto důvodu jsou NK buňky velmi studovanou skupinou buněk. Tato práce se zabývá produkcí Clrb ("C-type-lectin-related protein b"). Tento protein je ligandem pro inhibiční receptor potkaních NK buněk NKR-P1B. Pokud napadená buňka na svém povrchu...
|
host ::
RSS.