|
|
Studium buněčných a molekulárních mechanismů interakce B-buněk s intracelulárním patogenem Francisella tularensis
Bramborová, Lucie ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Krejsek, Jan (oponent) ; Šinkorová, Zuzana (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Lucie Bramborová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Školitel specialista: RNDr. Zuzana Kročová, Ph.D Název disertační práce: Studium buněčných a molekulárních mechanismů interakce B-buněk s intracelulárním patogenem Francisella tularensis F. tularensis je Gram-negativní, fakultativně intracelulární bakterie způsobující zoonózu tularémii. Imunita vůči F. tularensis je hlavně zprostředkována T-buňkami, ale důležitou úlohu v časné fázi imunitní reakce mají také B-buňky. Hlavními hostitelskými buňkami pro F. tularensis jsou makrofágy. V makrofázích se bakterie usidluje ve fagozómu, ze kterého následně uniká do cytosolu. Zde se F. tularensis množí a indukuje apoptózu a později nekrózu hostitelských buněk. Vliv B-buněk na časnou imunitní reakci proti F. tularensis je studován teprve v posledních letech. Elkins a spol. prokázali silnou časnou protekci u myší závislou na B-buňkách. Přímá interakce B-buněk a F. tularensis zatím nebyla popsána. Během naší práce jsme pozorovali adhezi F. tularensis na lidské a myší B-buňky, detekovali jsme bakterie uvnitř buněk, většinou v membránami uzavřených vakuolách a následně jsme pozorovali morfologické změny mitochondrií buňky. B-buňky infikované F. tularensis...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské 17beta-HSD1
Popovská, Lenka ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Řešitel: Bc. Lenka Popovská Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské 17β-HSD1 17β-hydroxysteroiddehydrogenasa typu 1 (17β-HSD1; SDR28C1; EC 1.1.1.62) patřící do nadrodiny SDR katalyzuje NAD(P)(H) dependentní oxidoredukci oxo/β-hydroxylové skupiny na sedmnáctém uhlíku androgenních a estrogenních hormonů. Tento reversibilní konverzní přesmyk mezi 17β-OH receptorovým ligandem a jeho 17-oxo inaktivním metabolitem představuje důležitý prereceptorový kontrolní mechanismus jaderných receptorových ligandů. Estradiol je nejúčinnější ženský pohlavní steroidní hormon a jako jediný je zodpovědný za účinky estrogenů u žen. Primárním zdrojem estradiolu přítomného v oběhu u žen před menopauzou jsou vaječníky, cirkulující estron a androgeny pocházející z nadledvin jsou v periferních tkáních (jako např. v tkáni tukové) také přeměněny na estradiol, a to díky enzymu 17β-HSD1. U žen v menopauze je hlavním zdrojem estrogenů periferní tkáň, kde dochází k jejich biosyntéze. Pro přípravu rekombinantního proteinu 17β-HSD1 byly použity bakterie E. coli DH10B s vloženým plasmidem pOTB7, který obsahoval kódovou sekvenci žádaného enzymu. Daná sekvence byla z plasmidu...
|
|
|
Effect of vitamin E on oxidative stress and the basement membrane in lungs in vitamin A-defficient rats
Fabšíková, Katarína ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Katarína Fabšíková Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Efekt vitamínu E na oxidační stres a na bazální membránu plic potkanů s nedostatkem vitamínu A V experimente popísanom v tejto diplomovej práci sa sledoval efekt dlhodobého nedostatku vitamínu A na bazálnu membránu pľúc potkanov. Potkany boli počas celého pokusu rozdelené do viacerých skupín líšiacich sa zložením potravy a pozorovali sa zmeny pľúcnej bazálnej membrány. Následne sa pozoroval efekt vitamínu E a kyseliny retinovej na vzniknuté zmeny v membráne. Počas experimentu bola hodnotená miera oxidačného stresu prostredníctvom hladín glutatiónu a malóndialhedydu, ktoré vystupujú ako jeho markery. Tieto hladiny boli u všetkých zvierat experimentu stanovované chromatografickou metódou HPLC. Taktiež sa hodnotil oxidačný stres pomocou iných ukazovateľov ako je hrúbka bazálnej membrány, depozitá kolagénových vlákien či hladiny retinolu a α-tokoferolu v plazme a v tkanivách. Tento experiment mal potvrdiť významnú úlohu vitamínov plniacich antioxidačnú funkciu ako v prevencii, tak aj v liečbe patologických zmien vzniknutých v dôsledku zvýšeného oxidačného stresu. Podávanie zvýšeného množstva vitamínu E a kyseliny...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C4
Kosánová, Kateřina ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Kateřina Kosánová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C4. AKR1C4 je jedním ze čtyř lidských enzymů podrodiny aldo-ketoreduktas AKR1C. Jde o monomerní cytosolický protein o velikosti 323 aminokyselin exprimovaný v játrech. Hraje významnou roli jak v metabolismu endogenních, tak i exogenních látek. Podílí se na metabolizaci steroidních hormonů a žlučových kyselin a nejrůznějších léčiv jako např. tibolonu nebo naltrexonu. Hraje roli i v aktivaci některých kancerogenních látek, jako jsou PAH. cDNA enzymu byla dodána v buňkách E. coli DH10B, vložená do vektoru pDNR-LIB. Po rozbití buněk a izolaci plasmidu byla kódující sekvence namnožena pomocí PCR. Následně byla díky štěpícím místům pro Nde I a Xho I endonukleasy, které byly součástí primerů pro PCR, zaligována do vektoru pET-28b. Takto připravený rekombinantní plasmid byl transformován pomocí tepelného šoku do buněk E. coli HB101. Po svém namnožení byl ligovaný plasmid transformován do buněk BL21. Upravené buňky BL21 byly využity k expresi proteinu. Pro indukci overexprese byl použit IPTG. Čistý rekombinantní protein AKR1C4 se získal pomocí ÄKTA purifikace na chelatačních...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C1
Vomočilová, Iva ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Iva Vomočilová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C1 Práce je zaměřena na syntézu lidského proteinu AKR1C1. Kódová sekvence pro tento protein byla objednána v podobě cDNA, která byla vložena do plazmidu pOTB7. Dodané buňky Escherichia coli, nesoucí takto upravený plazmid, byly namnoženy a plazmid byl purifikován pomocí alkalické lýzy. S purifikovaným plazmidem byla provedena polymerasová řetězová reakce s dvojicí navržených primerů, které obsahovaly restrikční místo. S ohledem na potřeby pozdějších reakcí byla zvolena rozpoznávací místa pro restrikční endonukleasy NdeI a XhoI. Pro ověření kvality purifikace plazmidu a úspěšnosti PCR byla použita horizontální elektroforéza. Produkt PCR byl purifikován s využitím elektroforézy na ultra-čisté agaróze. Jako vektor byl zvolen plazmid pET-28b(+). Ten byl namnožen v předem upravených buňkách E. coli HB101 a následně purifikován. Purifikovaný plazmid a purifikovaný produkt PCR byly štěpeny pomocí restrikčních endonukleas XhoI a NdeI. Oba naštěpené úseky byly přečištěny a s využitím T4 DNA ligasy byl fragment PCR vložen do otevřeného vektoru pET-28b(+). Takto upravený plazmid byl...
|
|
|
Účast membránově vázaných enzymů v metabolismu xenobiotik u člověka
Skarka, Adam ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Bílková, Zuzana (oponent) ; Hodek, Petr (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Katedra biochemických věd Kandidát Mgr. Adam Skarka Školitel Prof. Ing .Vladimír Wsól, Ph.D. Název disertační práce Účast membránově vázaných enzymů v metabolismu xenobiotik u člověka Cizorodé látky zvané xenobiotika se běžně vyskytují v širokém okolí člověka. Některé z nich jsou aktivně či pasivně přijímány do organismu a podstupují metabolickou přeměnu vedoucí k jejich vyloučení. Důležitou roli v tomto případě hrají různé enzymové systémy. Nejznámějším systémem je nadrodina cytochromů P450 katalyzující oxidační reakce, avšak v poslední době nabývají na významu i systémy redukční, mezi které patří například nadrodiny dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem (SDR), dehydrogenas/reduktas se středně dlouhým řetězcem (MDR) a aldo ketoreduktas (AKR). Karbonylová skupina, která je cílem redukce katalyzované nadrodinami SDR, MDR a AKR, se nachází také u různých skupin léčiv, např. antineoplastik a nesteroidních antiflogistik. Přeměna této skupiny může vést ke ztrátě účinku a/nebo ke zvýšení toxicity daného léčiva pro organismus. Některá xenobiotika mají ve své struktuře tzv. prochirální funkční skupinu. Mezi takové patří například již zmíněná karbonylová skupina, jejíž přeměnou může dojít ke vzniku chirálních produktů. Poměr...
|
|
|
Regulation of Human Carbonyl Reductase 3 (CBR3) Expression
Malátková, Petra ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Pávek, Petr (oponent) ; Machala, Miroslav (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát Mgr. Petra Malátková Školitel Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název disertační práce Regulace exprese lidské karbonylreduktasy 3 (CBR3) Regulace exprese lidské karbonylreduktasy 3 (CBR3) byla až donedávna zcela neznámá a stále není plně objasněna. Transkripční regulace genu úzce souvisí s funkcí proteinu, který kóduje. Proto lze očekávat, že objasnění regulace CBR3 pomůže porozumět fyziologické funkci tohoto enzymu, která dodnes zůstává záhadou. Promotor genu CBR3 byl popsán v roce 2009. CBR3 promotor obsahuje několik potenciálních vazebných míst pro různé transkripční faktory. V roce 2010 jsme prokázali, že exprese CBR3 je regulována signální dráhou Nrf2/ARE. Šlo o první studii popisující transkripční regulaci CBR3. Zapojení Nrf2 do regulace CBR3 bylo nedávno potvrzeno studií jiného výzkumného týmu. Funkční antioxidační responzivní element (ARE) se nachází 2698 párů bází proti směru iniciace translace CBR3 (−2698ARE). Analýza promotoru CBR3 o délce 2500 párů bází nicméně naznačila přítomnost cis- regulačního elementu v sekvenci mezi 2500 a 500 párů bází proti směru transkripce. Zdá se tedy, že i jiný responzivní element než −2698ARE může regulovat CBR3. Protože promotor genu CBR3 obsahuje...
|
|
|
Role of systemic inflammation in Parkinson's disease
Veselá, Karolína ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd University of Seville, Faculty of Pharmacy Department of Biochemistry and Molecular Biology Kandidát: Karolína Veselá Školitelé: Prof. Dr. José Luis Venero Recio, Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Systémový zánět v patogenezi Parkinsonovy choroby. Parkinsonova choroba (PD) je po Alzheimerově chorobě druhé nejčastější neurodegenerativní onemocnění, a s rostoucím průměrným věkem populace prevalence stále roste. Charakteristické příznaky jsou způsobeny úbytkem nervového přenosu v dopaminergní nigrostriatální dráze, přičemž patogeneze této neurodegenerace není doposud objasněna. Rostoucí poznatky ukazují, že klíčovým mechanismem je bludný kruh oxidativního stresu a patologické aktivace mikroglií, avšak otázky, kde tento proces začíná a jak ho zastavit, zůstávají bez jasných odpovědí. Tato práce se zabývá rolí systémového zánětu jako faktoru zhoršujícího neurodegeneraci a jednou z možných příčin vyvolávajících chronický zánět v mozku spojený s úbytkem dopaminergních neuronů. Používá model intraperitoneálního podání neurotoxinu 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridinu (MPTP) myším, který navozuje specifickou dopaminergní neurodegeneraci, a na rozdíl od ostatních modelů PD nezpůsobuje...
|
|
|
Nitric oxide mediated functional effects in the normal and inflamed urinary bladder of the rat
Cabalková, Jana ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Jana Cabalková Školitelé: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D (Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy) Prof. Gunnar Tobin, O.D., Ph.D. (University of Göteborg in Sweden, Sahlgrenska academy) Název diplomové práce: Funkční účinky zprostředkované oxidem dusnatým u normálního a zánětlivého močového měchýře potkana. Intersticiální cystitida (IC) je stav charakterizovaný difúzním zánětem. Postihuje hlavně ženy a příznaky zahrnují kromě bolesti, která je nejvýznamnějším znakem, nutkání a frekvenci na močení. Etiologie a patogeneze IC jsou, navzdory mnoha letem výzkumu, do značné míry neznámé. Doposud se výzkum zaměřoval především na změny vyvolané intersticiální cystitidou na úrovni senzorického mechanismu u reflexního oblouku močení. Důvodem je zejména to, že hladiny neurotransmiteru ATP, který je aktivátor senzorické dráhy, jsou výrazně zvýšeny u pacientů trpících IC. Nicméně, jsou zde další dvě důležité molekuly v spojené s patologií IC-oxid dusnatý (NO) a acetylcholin, které nemají vliv pouze na aferentní dráhu v reflexu oblouku, ale ovlivňují také eferentní část. Tento projekt byl zaměřen na mechanismus účinku NO u normálního a zánětlivého močového měchýře potkana. Vliv argininu a nitroprusidu...
|
|
|
On Purinoceptors in the Rat Urinary Bladder
Veselá, Renata ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Študent, Vladimír (oponent) ; Broďák, Miloš (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát Mgr. Renata Veselá Školitel Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název disertační práce Purinoceptory močového měchýře potkana Močový měchýř regulují obě větve autonomního nervového systému. Vedle klasických neurotransmiterů, noradrenalinu a acetylcholinu, jsou to i jiné autonomní neurotransmitery a signální molekuly, co hrají zásadní roli ve fyziologických a patologických procesech dolních močových cest. Intersticiální cystitida (IC) je chronické onemocnění močového měchýře, které není způsobeno žádným infekčním agens, je neznámé etiologie a patofyziologie. Klinickým obrazem jsou časté a náhlé nucení na močení a ostrá abdominální bolest, která ale během močení slábne. Non-adrenergní, non-cholinergní (NANC) systémy ovlivňují funkční změny v měchýři během jeho zánětu. Cílem této disertační práce bylo odhalit purinergní a nitrergní mechanismy, které by mohly být součástí patogeneze IC a urodynamické dysfunkce. Metody: Jednorázová intraperitoneálně podaná dávka cyklofosfamidu (CYP) způsobuje CYP-indukovanou cystitidu; tedy stav velmi podobný IC, a z tohoto důvodu se tedy CYP-indukovaná cystitida využívá jako model pro studium IC. I my jsme během našich experimentů tento model využívali. Činnost hladké...
|
host ::
RSS.