|
| |
|
|
Regulace alternativniho sestřihu
Dušková, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Trejbalová, Kateřina (oponent)
Alternativní sestřih pre-mRNA je důležitým buněčným mechanismem, který umožňuje produkci velkého množství proteinových isoforem z omezeného množství genů. Na regulaci sestřihu alternativních exonů se podílí cis-elementy na pre-mRNA a trans-vazebné faktory (SR a hnRNP proteiny). Vzhledem k tomu, že sestřih probíhá během transkripce, začíná se uvažovat o možné roli struktury chromatinu v regulaci alternativního sestřihu. V této diplomové práci jsme studovali vliv histonové acetylace na alternativní sestřih. Na bázi alternativního exonu EDB, který se nachází ve fibronektinovém genu, jsme vytvořili sestřihový reportér. Ukázali jsme, že inhibice histonových deacetyláz ovlivňuje alternativní sestřih EDB exonu z reportéru stejně jako sestřih endogenního exonu. Dále jsme ukázali, že struktura promotoru má vliv na sestřih alternativního EDB exonu z sestřihového reportéru. Zároveň jsme zjistili, že struktura promotoru ovlivňuje míru acetylace histonu H4 na reportérech. Vkládání EDB exonu do mRNA bylo nepřímo úměrné histonové acetylaci reportéru. Tyto výsledky by mohly vysvětlit proč odlišné promotory mají různé sestřihové poměry alternativních exonů.
|
|
|
Analýza regulace komplexů cytoplazmatických poly(A) polymeráz
Novák, Jakub ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hrossová, Dominika (oponent)
Regulace genové exprese je dosahováno mnoha způsoby. Výzkum se dlouhá léta zaměřoval především na regulaci genové exprese na úrovni chromatinu, nicméně posttranskripční regulace se na cestě k syntéze proteinů ukazuje být jejím nezbytným doplňkem. Tato práce se zaměřuje na studium jednoho specifického mechanismu posttranskripční kontroly - regulace translace mRNA v buněčné cytoplazmě. Tato regulace je důsledkem rovnováhy mezi aktivací a represí translace a závisí na selektivním rozpoznání cílových mRNA RNA-vazebnými proteiny a jejich schopností navazovat proteiny modifikující RNA. V této práci byla zárodečná linie Caenorhabditis elegans využita ke studiu translační regulace mRNA genu hojně exprimovaného v zárodečné linii, gld-2. Mutanti známých RNA-vazebných proteinů z rodin proteinů PUF a CPB byli analyzováni pomocí Western blotů za použití protilátek proti GLD-2. K identifikaci cis-regulačních míst na gld-2 mRNA, zodpovídajících za regulaci translace PUF a CPB proteiny, bylo využito kvasinkového 3-hybridového systému. Také byl zkoumán potenciální autoregulační systém exprese genu gld-2. Tato práce ukazuje, že proteiny FBF pozitivně regulují expresi genu gld-2 a váží se na jednu konzervovanou sekvenci v nepřekládaném regionu na 3' konci jeho mRNA. Mutace v genu gld-2 negativně ovlivnily hladinu proteinu...
|
|
| |
|
|
Determinants of the splice site selection in protein-coding and long non-coding RNAs
Krchňáková, Zuzana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Svoboda, Petr (oponent) ; Blažek, Dalibor (oponent)
Ve své dizertační práci jsem se zaměřila na několik málo proskoumaných oblastí regulace sestřihu RNA. V první části jsem analyzovala, jak chromatinové a transkripční regulační elementy mění sestřih pre-mRNA. Ve druhé části jsem studovala, proč jsou dlouhé nekódující RNA méně efektivně stříhané než mRNA kódující proteiny. Nakonec jsem zkoumala důležitost intronu pro aktivační funkci dlouhých nekódujících RNA. Bylo ukázáno, že chromatin a promotor mění alternativní sestřih. Zde jsem testovala, zda lokální chromatinové a vzdálené genomové prvky, které ovlivňují transkripci, mohou také modulovat sestřih. Použila jsem enzymy modifikující histony a pomocí TALE technologie je navedla na specifické oblasti ve FOSL1 genu. Pomocí tohoto přístupu jsem ukázala, že změny metylace v lyzínu 9 histónu H3 ovlivňují konstitutivní sestřih. Navíc podávám důkaz, že odstranení transkripčního zesilovače vzdáleného několik kilobází od alternativního exonu mění sestřih alternativního exonu. Mnohé dlouhé nekódujíci RNA podléhají stejnému mechanizmu zpracování jako pre- mRNA genů kódujících proteiny, ale často jsou neefektivně sestřiženy. Abychom identifikovali základní mechanismy tohoto jevu, hledali jsme možné inhibiční sekvence sestřihu u těchto dlouhých nekódujících RNA. Celogenomová analýza ukázala, že obecně dlouhé...
|
|
|
Struktura a vlastnosti mutanty hPrp31 v Retinitis pigmentosa
Těšina, Petr ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Retinitis pigmentosa je dědičné onemocnění, které způsobuje postupné odumírání světločivných buněk a pigmentového epitelu sítnice oka v degenerativním procesu, který představuje jednu z nejčastějších příčin poškození zraku a slepoty. Jde o geneticky velice heterogenní nemoc. Geny, jejichž mutace ji způsobují, jsou většinou exprimovány pouze v buňkách fotoreceptorů. Výjimkou jsou čtyři geny kódující sestřihové faktory účastnící se pre-mRNA sestřihu, které jsou nezbytné pro přežití všech transkripčně aktivních buněk lidského těla. Je proto překvapivé, že mutantní formy těchto proteinů způsobují onemocnění postihující specificky fotoreceptory. Jedním z těchto sestřihových faktorů je i hPrp31, jehož mutantní forma označovaná jako AD29 je hlavním předmětem této práce. Některé účinky této mutace na buněčné úrovni byly nedávno publikovány. V této práci je prezentována tvorba expresního vektoru, exprese a purifikace úseku AD29 mutantní formy proteinu hPrp31. Purifikovaný produkt byl použit k produkci polyklonální králičí protilátky, jejíž použití pro imunofluorescenční značení a western blot bylo úspěšně testováno. Dále je ukázáno objevení nového účinku AD29 mutace, který je zřejmě zodpovědný za některé její negativní projevy na buněčné úrovni, a srovnání struktur úseků 78-333 wild-type a AD29 forem pomocí...
|
|
| |
|
|
The role of coilin in snRNP quality control
Kuzmenko, Darya ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Abrhámová, Kateřina (oponent)
Savčí geny jsou transkribovány ve formě prekurzorů - pre-mRNA. Obsahují kódující sekvence (exony) a nekódující sekvence (introny). Sestřih, proces odstranění intronů a spojení exonů za účelem vytvoření zralé mRNA, se provádí pomocí spliceosomu. Spliceosom se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových (snRNP) částic a četných asociovaných proteinů. Jeho skládání je složitým procesem, kterého se účastní specifický jaderný subkompartment, Cajalovo tělísko (CB). V této práci zkoumáme funkci CB scaffoldového proteinu, coilinu, při kontrole kvality snRNP v HeLa buňkách. Sekvestrace nehotových snRNP částic v buňkách bez coilinu je analyzována pomocí fluorescenční in situ hybridizace. Ukazujeme, že buňky bez coilinu nejsou schopny nehotové snRNP částice zachytit. Dále, poskytujeme důkazy, že nepřítomnost coilinu nezvyšuje citlivost HeLa buněk vůči defektům ve zrání snRNP částic z hlediska buněčné proliferace. Navíc, nedostatek coilinu nevede k významným změnám hladin U4, U5 nebo U6 snRNA. Proto se coilin, a tudíž ani Cajalova tělíska, nestávají nezbytnými v podmínkách defektní biogeneze snRNP částic.
|
|
|
Molecular mechanism of quality control during snRNP biogenesis
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Sestřihový komplex patří mezi největší a nejdynamičtější molekulární mašinérie v buňce. Hlavní část komplexu je tvořena pěti malými jadernými ribonukleoproteinovými částicemi (zkráceně snRNP). Ty vznikají složitým procesem, který je rozdělen do několika kroků. SnRNP částice jsou navíc během sestřihu výrazně přestavěny a po každé sestřihové reakci proto musí dojít k jejich regeneraci. Jak skládání nových snRNP, tak recyklaci post-sestřihových částic řídí a usnadňují specializované chaperony. V této práci jsem se zaměřila na dva chaperony snRNP částic, SART3 a TSSC4, a odhalila molekulární detaily jejich funkce. Zatímco TSSC4 nebyl dříve charakterizován, SART3 byl popsán jako faktor specifický pro U6 snRNP, který napomáhá sloučení U6 a U4 částic do di-snRNP komplexu a je důležitý pro recyklaci použitých U4/U6 snRNP. Mechanismus, kterým funguje, byl však nejasný. V této práci přináším důkaz, že SART3 interaguje s post-sestřihovým komplexem a navrhuji, že by se SART3 mohl podílet na jeho rozpadu. Naše data dále naznačují, že se SART3 váže na U6 snRNP už v rámci post-sestřihového komplexu a koordinuje tak celou recyklační fázi U6 částice. Dále zde ukazuji, že TSSC4 je nový chaperon specifický pro U5 snRNP a že napomáhá U5 a U4/U6 částicím, aby se složily do finálního tri-snRNP komplexu. Identifikovali...
|
|
|
Quality control in snRNP biogenesis
Roithová, Adriana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Malínský, Jan (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
v češtině snRNP patří k nejdůležitějším částem sestřihového komplexu. Jejich životní cyklus se odehrává v cytoplasmě, kde probíhají první fáze jejich biogeneze, a také v jádře, kde plní svoji hlavní funkci. Všechny snRNP jsou složeny z krátké nekódující RNA, z Sm či LSm proteinů tvořící 7-členný kruh a z proteinů specifických pro každý snRNP. Jejich životní cyklus začíná v jádře, kde jsou transkribovány RNA polymerázou II nebo III. Poté jsou transportovány do cytoplasmy. Během své cytoplasmatické fáze se formuje Sm kruh kolem specifické sekvence na RNA pomocí SMN komplexu a následně se trimetyluje čepička na 5'konci snRNA. Tyto 2 úpravy jsou signálem, že je snRNP připravena na transport do jádra, kde je hromaděna v jaderných strukturách nazývající se Cajalova tělíska. V Cajalových tělískách probíhá finální část jejich zrání. Průběh snRNP biogeneze je průběžně kontrolován. První kontrola probíhá v jádře ihned po jejich transkripci a následuje vytvoření exportního komplexu. Druhý kontrolní bod je v cytoplasmě a zahrnuje tvorbu Sm kruhu. Víme, že Sm kruh je tvořen SMN komplexem ale detailní mechanismus je stále neznámý. Pokud snRNA neprojde těmito kontrolními body, tak je v cytoplasmě degradována. Avšak, jak buňka rozlišuje mezi normálními a defektními snRNA se stále neví. Třetí a poslední kontrolní...
|
host ::
RSS.