|
|
Využití nových metod analýzy genomu ve studiu molekulární podstaty vzácných geneticky podmíněných onemocnění.
Přistoupilová, Anna ; Kmoch, Stanislav (vedoucí práce) ; Sedláček, Zdeněk (oponent) ; Pačes, Jan (oponent)
Vzácná onemocnění představují heterogenní skupinu více než ~7000 různých onemocnění, která postihují 3,5-5,9 % celosvětové populace. Většina vzácných onemocnění je genetických, ale kauzální geny jsou známy jen u některých z nich. Řada pacientů se vzácným onemocněním zůstává bez diagnózy, která je klíčová pro genetické poradenství, prevenci a léčbu. S rozvojem nových metod analýzy genomu, klesající cenou sekvenování a rostoucími znalostmi o lidském genomu byl nastolen nový koncept identifikace onemocnění podmiňujících genů, založený na porovnávání genetické variability pacienta s genetickou variabilitou běžné populace. Tato disertační práce popisuje nové metody sekvenace genomu (NGS), bioinformatickou analýzu získaných dat a jejich využití ve studiu molekulární podstaty vzácných, geneticky podmíněných onemocnění. Tyto postupy vedly k určení a charakterizaci kauzálních genů a genových mutací u autosomálně dominantního tubulointersticiálního onemocnění ledvin (SEC61A1, MUC1), autosomálně dominantní neuronální ceroidní lipofuscinózy (CLN6, DNAJC5), neurodegenerativního onemocnění neznámé etiologie (VPS15), Akadské varianty Fanconiho syndromu (NDUFAF6) a spinální svalové atrofie (SMN1). Zavedením nových metod analýzy genomu se zvýšila diagnostická výtěžnost vzácných onemocnění z původního 1 % na 50 %....
|
|
|
Studium exprese mutantních alel a stavu X inaktivace ve vztahu ke klinickým projevům vybraných monogenních X vázaných onemocnění
Černá, Alena ; Dvořáková, Lenka (vedoucí práce) ; Sedláček, Zdeněk (oponent)
U žen nalézáme dvojnásobný počet X-vázaných genů oproti mužům, neboť mají dva chromozomy X, zatímco muži jsou pro X-vázané geny hemizygoti. Tato nerovnováha je kompenzována v průběhu časné embryogeneze procesem X-inaktivace (XCI), tzv. primární X- inaktivace. Inaktivace chromozomu X je náhodný proces, přičemž ženy jsou mozaiky dvou buněčných populací. Poměr exprimovaných alel u žen může být náhodný (cca 50:50) nebo nevyvážený (≥80:20). K nevyvážené XCI může dojít v důsledku selekce, kdy je preferenčně inaktivována jedna z alel. V tomto případě mluvíme o sekundární XCI. V této diplomové práci jsme prováděli stanovení inaktivace chromozomu X u heterozygotních žen s různou závažností fenotypových příznaků u vybraných X vázaných dědičných metabolických onemocnění. Naším hlavním zájmem byla Fabryho choroba (deficit enzymu α- galaktosidázy A kódovaného genem GLA). Dále jsme studovali XCI u jedné rodiny s X- vázanou agamaglobulinémií. Zabývali jsme se studiem mutantních alel a stavu XCI na základě analýzy různých lokusů, různých metodických přístupů a různých tkání. Poprvé jsme využili přímou analýzu transkriptu genu GLA k detekci poměru alel. K alelově specifické expresi (ASE) jsme dále využili jednonukleotidových polymorfismů v genech IDS a LAMP2. K methyl-senzitivní restrikční analýze (MSRA) jsme...
|
|
| |
|
|
Korelace genotyp-fenotyp u vybraných vzácných onemocnění s využitím molekulární analýzy genomových a genových variant
Vlčková, Markéta ; Sedláček, Zdeněk (vedoucí práce) ; Gaillyová, Renata (oponent) ; Baxová, Alice (oponent)
Práce byla zaměřena na podrobnou analýzu pacientů se vzácnými genomovými a genovými variantami. Studován byl vliv těchto variant na fenotyp pacientů. Vzhledem k tomu, že většina našich pacientů, ať už syndromických nebo nesyndromických, byla k podrobnějšímu vyšetření indikována z důvodu mentální retardace a/nebo poruchy autistického spektra, byla práce zaměřena na tyto dvě klinické jednotky. Nejprve byli k analýze vybráni pacienti s mikroskopicky detekovanými chromozomálními aberacemi, jejichž rozsah, genový obsah a mechanismus vzniku byly upřesněny pomocí molekulárně genetických metod, nejčastěji array CGH s vysokým rozlišením. Později byli analyzováni pacienti se vzácnými nebo jedinečnými submikroskopickými aberacemi, zjištěnými právě pomocí aCGH nebo SNP array. S využitím těchto metod jsme v průběhu práce analyzovali pacienty s delecemi Xp22.1-p22.3, 6q11-q13, 6q14-q16, Xq25, 1q21.1, Xp21.2-p21.3, 2p14-p15, 17q21.31, 9q21.3 a 2p15-p16.1, a pacientku s duplikací Xp21.2-p21.3. V posledních letech jsme přistoupili k analýze syndromických pacientů metodami sekvenování nové generace. Tak byly odhaleny varianty v genech HCFC1, KAT6B, SOS2 a KMT2D, které byly dále studovány. Práce přispěla k poznatkům o vlivu nalezených genomových a genových variant na fenotyp pacientů, o mechanismech vzniku genomových...
|
|
|
Využití metody paralelního sekvenování při stanovování zešikmení X inaktivace
Veselková, Tereza ; Dvořáková, Lenka (vedoucí práce) ; Sedláček, Zdeněk (oponent)
Zešikmení inaktivace chromozomu X je často studováno v souvislosti s projevy X-vázaných onemocnění u žen, přičemž u většiny chorob není vliv míry zešikmení na fenotyp zcela objasněn. Převážná část studií pro určení poměru inaktivace chromozomů X využívá metody založené na methylačně senzitivní restrikci, nejčastěji konkrétně metodu HUMARA, která vychází z profilu methylace v genu AR. Nicméně tento způsob testování má některé své nevýhody, a proto jsou stále hledány nové metodické přístupy. V naší práci jsme ve skupině 54 žen stanovovali míru zešikmení X inaktivace z DNA izolované z krevních buněk a v některých případech také z bukálních stěrů pomocí methylačně senzitivní restrikce v lokusech AR, CNKSR2 a RP2. U 32 z těchto žen, u nichž bylo možné z krve izolovat celkovou RNA, jsme využili též metodu, která je založena na kvantifikaci transkriptu pomocí paralelního sekvenování, přičemž k analýze jsme použili polymorfismy LAMP2 c.156A>T, IDS c.438C>T a ABCD1 c.1548G>A. Nejvíce informativní metodou v námi studované skupině byla methylačně senzitivní restrikce v lokusu RP2 (71 %), a to i díky malému počtu "stutter" vrcholů vznikajících při PCR. Přibližně stejné množství žen (69 %) bylo informativních v lokusu AR. Při porovnání výsledků těchto dvou metod jsme však v některých případech zaznamenali...
|
|
|
Využití nových genomických technik ve studiu patogeneze vybraných vzácných dědičných onemocnění.
Nosková, Lenka ; Kmoch, Stanislav (vedoucí práce) ; Sedláček, Zdeněk (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Vzácná onemocnění jsou heterogenní skupinou onemocnění, jejichž molekulární podstata je často neznámá. Pro jejich studium nebyly donedávna z důvodů malého počtu pacientů k dispozici vyhovující metodické postupy. Díky novým přístupům ke studiu genomu, především díky technologiím DNA čipů a s rozmachem sekvenování nové generace, je v současné době možno studovat vzácná onemocnění i u jednotlivých rodin nebo u sporadických případů. Tato dizertační práce se zabývá aplikací nových genomických technik při studiu vzácných dědičných chorob. Popisuje využití technologie DNA čipů pro účely vazebné analýzy, analýzy změn genové exprese, analýzy změn počtu kopií a homozygotního mapování a dále využití sekvenování nové generace. Kombinace těchto metodických postupů byly použity pro studium molekulární podstaty adultní formy neuronální ceroidní lipofuscinózy, Rotorova syndromu, izolovaného defektu ATP syntázy a mukopolysacharidózy typu IIIC.
|
|
|
Analýza variant v počte kópií (CNV) v genómoch pacientov s mentálnou retardáciou
Hančárová, Miroslava ; Sedláček, Zdeněk (vedoucí práce) ; Gaillyová, Renata (oponent) ; Michalová, Kyra (oponent)
Mentálna retardácia (MR) je časté veľmi heterogénne neurovývojové ochorenie, s prevalenciou v populácii 2,5-3 %. Prispenie genetických faktorov k rozvoju MR je vysoké, ale v mnohých prípadoch zostáva etiológia ochorenia neobjasnená. Najnovšie štúdie prostredníctvom arrayových metód poukázali na častejší výskyt variant v počte kópií (copy number variants - CNV) u pacientov s týmto ochorením. Patogénne CNV boli identifikované u 10-15 % pacientov s idiopatickou MR a normálnym karyotypom. Cieľom práce bola celogenómová analýza ziskov a strát genetického materiálu v súbore českých pacientov s MR a dôkladná bioinformatická analýza zistených genetických zmien pre určenie ich pravdepodobného klinického významu. Celogenómová analýza s využitím HumanCytoSNP-12 BeadChips (Illumina) bola prevedená u 183 pacientov s idiopatickou MR, normálnym karyotypom a bez expanzie v géne FMR1. Získané dáta boli analyzované dvoma nezávislými programami, a to GenomeStudio a QuantiSNP a ich výsledky boli následne podrobené dvom kolám dôkladnej bioinformatickej analýze. Výsledkom tejto analýzy bola klasifikácia CNV do 4 rôznych kategórií: patogénne CNV, pravdepodobne patogénne CNV, CNV s nejasnou klinickou signifikanciou a benígne CNV. S výnimkou benígnych CNV boli všetky ostatné CNV potvrdzované nezávislou metódou ako FISH, MLPA, QFPCR...
|
|
| |
|
|
Molecular Basis of Familial Hyperuricemic Nephropathies
Živná, Martina ; Kmoch, Stanislav (vedoucí práce) ; Jirsa, Milan (oponent) ; Sedláček, Zdeněk (oponent)
In 1960 Duncan and Dixon described family whth chronic tubulointerstitial kidney disease associated with juvenile onset of hyperuricemia and gout. Based on combination of these clinical symptoms they named the disease familial juvenile hyperuricemic nephropathy (FJHN) [1]. Disease with very similar clinical presentation but different age of onset and kidney histology was described as a medullary cystic kidney disease (MCKD) in 1977 [2]. Until recently the molecular basis and pathogenesis of this syndrome remained unknown. The long term aim of our research group is to elucidate the genetic basis of the disease and to solve pathogenetic mechanisms leading to the individual clinical and biochemical symptoms (e.g. hyperuricemia) and kidney damage in general. We systematically identify patients with this disease and healthy family members and collect relevant clinical information and samples for classification (urine, blood, tissue biopsies) and subsequent clinical, biochemical, molecular biology and cell pathology correlations. We [3, 4] and others [5-7] proved genetic heterogeneity of FJHN and defined four FJHN loci on chromosomes 1q21, 1q41, 16p11.2. and 17q21.3. Further research defined disease causing mutations in three genes - uromodulin (UMOD) [8], hepatonuclear factor 1-beta (HNF-1) [9] and renin (REN)...
|
|
|
Molekulárně genetická analýza syndromu fragilního chromozomu X a myotonické dystrofie
Mušová, Zuzana ; Sedláček, Zdeněk (vedoucí práce) ; Fajkusová, Lenka (oponent) ; Maxová, Alica (oponent)
SHRNUTÍ Práce je zaměřena na tři závažné choroby podmíněné jedinečným mutačním mechanismem - expanzí krátkých tandemových repetic. Syndrom fragilního chromozómu X je nejčastější příčinou X-vázané mentální retardace. Myotonické dystrofie typu 1 a 2 jsou nejčastějšími muskulárními dystrofiemi u dospělých. Práce shrnuje poznatky získané na velkých souborech pacientů shromážděných v rámci rutinní DNA diagnostiky těchto chorob. Byla zavedena široká paleta metod pro co nejrychlejší a nejpřesnější detekci expanzí, zejména rychlá fluorescenční PCR, TP-PCR a RP-PCR. Jako alternativní a doplňující metoda je stále využíván Southernův blot. Na základě získaných zkušeností a doporučení EMQN byl navržen optimální diagnostický protokol spočívající na promyšlené kombinaci těchto metod. Záchyt syndromu fragilního chromozómu X v souboru 1880 pacientů a jejich příbuzných indikovaných na testování FXS byl 4,5%. Ve shodě s literaturou byly pozorovány typické zákonitosti intergeneračního přenosu alel genu FMR1. Jedna pacientka s plným projevem FXS měla přednostní inaktivaci druhého chromozómu X postiženého intersticiální delecí. U dvou pacientů s FXS byly popsány zvláštní koincidence s karyotypem 47,XYY. V rodinách s FXS byl identifikován jeden pacient s jistým a jedna pacientka s možným onemocněním FXTAS. Další pacient byl...
|
host ::
RSS.