|
| |
|
|
Význam dipeptidylpeptidázy-IV a homologních proteáz v procesech migrace a invaze.
Fejfarová, Edita ; Bušek, Petr (vedoucí práce) ; Rösel, Daniel (oponent)
Migrace a invaze jsou děje probíhající přirozeně v organismu během embryogeneze, při imunitních reakcích či hojení ran. Velice důležitým faktorem jsou také u řady závažných onemocnění jako např. revmatická artritida a maligní nádory. Význam proteolytických enzymů v těchto procesech je nesporný - podílejí se na degradaci extracelulární matrix a tím usnadňují pohyb buňky. Dipeptidylpeptidáza-IV (DPPIV) odštěpuje pouhé dvě aminokyseliny od N-konce a na degradaci ECM se nepodílí. Rozpoznává a štěpí krátké peptidy mající jako předposlední AA prolin, který svému držiteli obvykle zajišťuje rezistenci vůči běžným typům proteáz. Mezi substráty DPPIV a homologních proteáz patří chemokiny uplatňující se v signalizaci migrace, jako jsou SDF-1 a RANTES či neuropeptid Y. Jejich štěpením a tím inaktivací se molekuly s DPPIV-podobnou aktivitou projevují jako modulátory migračního signálu na buňkách choriokacinomu, neuroblastomu, buňkách Sézaryho syndromu či epiteliálních buňkách migrujících v reakci na poranění. Dalším mechanismem proteáz s DPPIV-podobnou aktivitou je vazba na proteiny extracelulární matrix, čímž se spolupodílejí na adhezi buněk a tím ovlivňují jejich migrační schopnost. Vliv na migraci a invazi mohou mít i intracelulární enzymové homology DDP8 a DPP9, u kterých je mechanismus účinku již z...
|
|
|
Analysis of Src dynamics in cellular structures
Pelantová, Markéta ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent)
Src kináza je klíčovým elementem mnoha signálních drah, které ovlivňují buněčné procesy jako diferenciaci, proliferaci, motilitu či migraci. Deregulace její aktivity je spojena s rozvojem rakoviny. Pochopení její funkce v buňce je tedy zásadní. Aktivita Src kinázy přímo koreluje s její konformací; v aktivním stavu zaujímá otevřenou konformaci, ve stavu inaktivním je v uzavřené konformaci, stabilizované intramolekulárními interakcemi. Detekce konformace Src kinázy tak může být použita ke sledování její aktivity. V této práci byl vylepšen biosenzor, detekující změnu konformace Src kinázy a založený na metodě FRET, a to použitím mNeonGreenu jako nového akceptorového fluoroforu v již existujícím designu. Vlastnosti nového senzoru byly porovnány se senzorem původním. Nový senzor je schopen detekovat konformační změny Src kinázy a lze ho stabilně exprimovat v buňkách. Analýza aktivity Src kinázy ve fokálních adhezích potvrdila zvýšenou aktivitu Src v těchto strukturách. Ačkoli nový biosenzor v porovnání s původním nevykazuje vyšší citlivost ke konfromačním změnám Src, stále se jedná o validní a užitečný nástroj pro studium aktivity Src kinázy, který je díky vyššímu jasu mNeonGreenu vhodnější pro mikroskopické experimenty. Klíčová slova: Src, FRET, biosenzor, mikroskopie živých buněk, mNeonGreen
|
|
|
Příprava a testování nového proteinového senzoru mechanické tenze
Kolomazníková, Veronika ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Novotný, Ivan (oponent)
Protein p130Cas (lidský ortholog BCAR1) je jedním z hlavních substrátů kinázy Src a hraje tak důležitou roli v nádorové transformaci. Zvýšená exprese BCAR1 koreluje s růstem primárního nádoru, jeho agresivitou a zhoršenou prognózou onemocnění. Ve chvíli, kdy je protein lokalizován do fokálních adhezí slouží jako buněčný mechanosenzor a zprostředkovává interakci buňky s extracelulárním prostředím. Pro fungování proteinu jsou klíčové kotvící domény SH3 a CCH spolu se substrátovou doménou, která může být vlivem aplikované tenze natahována. Diplomová práce představuje nově zkonstruovaný FRET-biosenzor mechanické tenze založený na struktuře proteinu p130Cas. Senzor využívá kotvící domény p130Cas, díky kterým lokalizuje do fokálních adhezí a může detekovat mechanickou tenzi v živých buňkách. Klíčová slova: p130CAS, FRET, fokální adheze, mechanorecepce
|
|
|
Identification of novel substrates of PKN3 kinase and characterization of the role of phosphorylation in the regulation of Rho GAP activity
Dibus, Michal ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Petrák, Jiří (oponent)
Proteínová fosforylácia predstavuje jednu z najdôležitejších posttranslačných modifikácií v signálnom prenose a zohráva kľúčovú úlohu v regulácii väčšiny bunkových procesov, vrátane bunkového cyklu, komunikácie s extracelulárnym prostredím, bunkovej migrácie, alebo apoptózy. Fosforylácia je sprostredkovaná kinázami, deregulácia ktorých často negatívne ovplyvňuje vývoj a celkovú homeostázu a vedie k vzniku viacerých druhov ochorení, vrátane rakoviny. V tejto práci sme sa zamerali na identifikáciu nových substrátov kinázy PKN3, ktorá je známym regulátorom organizácie cytoskeletu a pro-malígneho rastu nádorov. Za použitia analóg-senzitívnej mutácie PKN3 sme urobili fosfoproteomický screen a identifikovali sme 281 proteínov, ktoré by potenciálne mohli byť fosforylované kinázou PKN3. Spomedzi týchto proteínov sme pre ďalší výskum vybrali ARHGAP18 z rodiny Rho GAP proteínov. Potvrdili sme, že PKN3 je schopná fosforylovať ARHGAP18 na Thr154, Ser156 a Thr158, a že tieto proteíny sú schopné vzájomnej interakcie v závislosti na izoforme ARHGAP18. Ďalej sme ukázali, že zámena týchto troch miest za fosfomimikujúci aspartát viedla k aktivácii GAP domény ARHGAP18, výsledkom čoho došlo k zníženiu hladiny aktívneho RhoA naznačujúc možnú existenciu negatívnej spätnej väzby v regulácii RhoA signalizácie. V druhej...
|
|
|
Úloha PKN kináz v nádorové transformaci
Novotná, Petra ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Ramaniuk, Volha (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá rodinou Ser/Thr kináz PKN. Ta zahrnuje tři izoformy PKN1, PKN2 a PKN3. Především se pak podrobněji zabývá kinázou PKN3. Jedná se o kinázy příbuzné s proteinkinázou C, patřící do superrodiny AGC. PKN kinázy jsou aktivované malými G proteiny z rodiny Rho GTPáz nebo nenasycenými mastnými kyselinami. PKN kinázy se účastní mnoha buněčných procesů, mezi které patří například regulace přestaveb cytoskeletu. Ovlivňují buněčnou adhezi, pohyb buněk, embryonální vývoj i buněčný cyklus. Exprese PKN3 je zvýšená zejména v rakovinových buňkách, ale v normálních tělních buňkách je jen v nepatrném množství. Z toho důvodu se PKN3 jeví jako velice zajímavý terapeutický cíl pro léčbu rakoviny. Studie ukazují, že PKN3 má značný vliv na motilitu rakovinových buněk, protože se podílí na jejich migraci a schopnosti tvorby metastáz.
|
|
|
Mechanosignalizace a mechanosezorické proteiny v adhezivních spojích
Hejnarová, Marie ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent)
Adhezivní spoje jsou součástí mezibuněčných kontaktů, kde napomáhají propojení aktino- vého cytoskeletu dvou a více sousedních buněk. V rámci tkáně zajišťují vnímání mechanických sil působících na buňky a následně vyvíjí adekvátní odpověď. Tyto procesy společně zajišťují proteiny, které sestavují mechanosenzitivní komplexy adhezivních spojů. V základním stavu v iniciačních mezibuněčných kontaktech je komplex tvořen kadheriny, β-kateniny a α-kateniny. Vnější síly působící na adhezivní spoje podporují konformační změny těchto proteinů, převážně pak α-kateninu a tím je umožněno vytvoření nových interakcí s dalšími vazebnými partnery. Mezi takové interaktory patří například EPLIN, vinkulin, nebo α-aktinin. Ti umožňují prová- zání kadherin-kateninového komplexu s aktinovými filamenty, pomocí kterých je umožněna na tenzi závislá změna morfologie buněk. Dále mohou tyto proteiny mechanickou sílu transformo- vat na regulační signál, který ovlivňuje aktivitu důležitých drah, jako je buněčná proliferace, diferenciace, nebo migrace. Tato mechanosenzitivní aktivita adhezivních spojů hraje důležitou roli v procesech udržujících integritu tkání. Znalosti ohledně vlivu mechanosenzingu adhezivních spojů na fyziologii tkání mohou přispět k porozumění vzniku patologií během embryogeneze, regenerace, nebo při...
|
|
|
The Role of Lck Kinase in T-cell Antigen Receptor Signaling
Němec, Dušan ; Štěpánek, Ondřej (vedoucí práce) ; Rösel, Daniel (oponent)
Aktivita LCK kinázy je nezbytně nutná pro zahájení procesu aktivace T lymfocytu. Primární funkcí LCK je převod informace o vazbě pMHC glykoproteinů na TCR do vnitřního prostředí buňky. Výsledkem kaskády, jež aktivní LCK spouští, je aktivace T buňky, produkce cytokinů, diferenciace a klonální expanze. Tato práce poskytuje souhrn současných znalostí o LCK kináze a její nenahraditelné roli v TCR signalizaci a stejně tak přehled nejvýznamnějších regulátorů a interakčních molekul. Dále pak popisuje význam interakce LCK s koreceptory pro optimální TCR signalizaci a fyziologický vývoj thymocytů a též zmiňuje diskutovanou roli LCK jako adaptorového proteinu T buněk. Klíčová slova: LCK, T lymfocyt, antigen, kináza, enzym
|
|
|
Příprava a testování nového proteinového senzoru mechanické tenze
Kolomazníková, Veronika ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Novotný, Ivan (oponent)
Protein p130Cas (lidský ortholog BCAR1) je jedním z hlavních substrátů kinázy Src a hraje tak důležitou roli v nádorové transformaci. Zvýšená exprese BCAR1 koreluje s růstem primárního nádoru, jeho agresivitou a zhoršenou prognózou onemocnění. Ve chvíli, kdy je protein lokalizován do fokálních adhezí slouží jako buněčný mechanosenzor a zprostředkovává interakci buňky s extracelulárním prostředím. Pro fungování proteinu jsou klíčové kotvící domény SH3 a CCH spolu se substrátovou doménou, která může být vlivem aplikované tenze natahována. Diplomová práce představuje nově zkonstruovaný FRET-biosenzor mechanické tenze založený na struktuře proteinu p130Cas. Senzor využívá kotvící domény p130Cas, díky kterým lokalizuje do fokálních adhezí a může detekovat mechanickou tenzi v živých buňkách. Klíčová slova: p130CAS, FRET, fokální adheze, mechanorecepce
|
|
|
Genetically encoded biosensors of cellular tension and their use in cellular biology
Pelantová, Markéta ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Lánský, Zdeněk (oponent)
1 Abstrakt a klíčová slova Mechanické síly mají velký vliv na celý život buněk. Ovlivňují buněčnou proliferaci, migraci či diferenciaci a chyby v buněčném vnímání mechanických sil se ukazují být jednou z příčin různých chorob jako je např. hluchota, ateroskleróza či rakovina. Mechanismy, kterými buňky mechanické síly vnímají, jsou nicméně ještě velmi málo probádány a chybějí nástroje, kterými by je bylo možné zkoumat. Geneticky kódované tenzní biosenzory využívající pro detekci tenze FRET jsou jednou ze současně používaných metod pro studium přenosu mechanického signálu v buňce. Jedná se o neinvazivní metodu, jejíž pomocí je možné v živých buňkách sledovat změny v mechanickém napětí na různých proteinech. V tomto textu jsou představeny různé typy existujících geneticky kódovaných tenzních biosenzorů využívajících FRET, proces jejich vytváření a objevy díky nim získané. Klíčová slova: mechanická síla, mechanosenzitivita, FRET, tenzní senzor, příprava biosenzoru
|
host ::
RSS.