|
|
Srovnání vybraných karbocyaninových fluorescenčních sond z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Mudroňová, Kateřina ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál je jednou z nejdůležitějších charakteristik živé buňky. Jednou z možností monitorování jeho změn je použití karbocyaninových fluorescenčních sond. V rámci této práce byly metodou synchronně skenované fluorescence prozkoumány vlastnosti několika sond. Z nich byly vybrány tři vhodné látky pro další experimenty jako doplněk k sondám diSC3(3) a diSC3(5), které představují standardní sondy používané v oddělení biofyziky FÚUK. Konkrétně se jedná o sondy diOC3(3), diIC1(3) a diIC2(5). Byla porovnána rychlost jejich akumulace v buňkách S. cerevisiae, na základě které jsme zjišťovali, zda jsou substráty MDR pump. Dále se tato práce zabývá otázkou ekvivalence výsledků obdržených pomocí různých fluoroforů a jejich vzájemného ovlivňování. Pro tyto účely byla zvolena dvojice sond diSC3(3) a diSC3(5), pomocí nichž byl zkoumán vliv acidifikace na membránový potenciál kvasinek S. cerevisiae. Bylo zjištěno, že informace o depolarizaci získané pomocí odlišných sond, se dobře shodují.
|
|
|
Měření vnitrobuněčné koncentrace iontů v mikroorganismech
Vodáková, Adéla ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Diplomová práce se zabývá měřením vnitrobuněčné koncentrace iontů v bakteriích Escherichia coli a kvasinkách Saccharomyces cerevisiae pomocí geneticky kódovaných fluorescenčních sond obsahujících zelený fluorescenční protein (GFP). V úvodu práce shrnuji známé poznatky o tomto proteinu a jeho spektrálních charakteristikách. Pro experimentální část práce byl vybrán senzor reagující na změny pH ve svém okolí změnou poměru intenzity fluorescence dvou pásů v excitačním spektru - poměrový pHluorin. Tato sonda byla otestována jak v bakteriálních, tak v kvasinkových buňkách. Byla sledována schopnost mikrobiálních buněk udržovat si stálou hodnotu cytosolického pH při odlišných vnějších podmínkách, jako je různé pH suspenze, přidání glukózy či KCl do suspenze. V práci je dále řešen problém odstranění příspěvku autofluorescence buněk ze signálu GFP při kalibraci a následném měření vnitrobuněčného pH. Úspěšně byla použita metoda synchronně skenované fluorescence pro potlačení nechtěných příspěvků. Při použití této metody navíc dochází k vylepšení poměru signálu k šumu a tím k zpřesnění odečítaných hodnot cytosolického pH.
|
|
|
Bioapplications of novel nanostructured materials
Fučíková, Anna ; Valenta, Jan (vedoucí práce) ; Polívka, Tomáš (oponent) ; Plášek, Jaromír (oponent)
Název práce: Bioaplikace nových nanostrukturních materiálů Autor: Anna Fučíková Katedra: Katedra chemické fyziky a optiky, Matematicko-fyzikální fakulta Univerzity Karlovy v Praze Vedoucí doktorské práce: Doc. RNDr. Jan Valenta, Ph.D. Katedra chemické fyziky a optiky, Matematicko-fyzikální fakulta Univerzity Karlovy v Praze Abstrakt: Tato práce se zabývá vývojem nových fluorescenčních značek na bázi křemíkových nanokrystalů. Pro srovnání jsou zkoumány také nanodiamanty a komerční kvantové tečky na bázi CdSe. Křemíkové nanokrystaly jsou malé (1-4 nm) ve srovnání s ostatními testovanými nanočasticemi; připravujeme je pomocí elektro-chemického leptání v roztoku HF. Povrch Si nanokrystalů lze aktivovat různými molekulami a tím modifikovat jejich luminiscenční vlastnosti. Luminiscence má kvantovou účinnost až 30 % a je relativně fotostabilní (na rozdíl od ostatních fluorescenčních značek, které vybělují) Si nanočástice jsou poměrně stabilní v biologickém prostředí, z dlouhodobého hlediska ovšem biodegradabilní a netoxické. Pomocí mikro-spektroskopie jsme schopni pozorovat jednotlivé luminiskující Si nanokrystaly a to i uvnitř živých buněk. Studované nanodiamanty vykazují pouze slabou luminiscenci, jsou velmi stabilní v biologickém prostředí, ale neodbouratelné a při větších koncentracích značně toxické. Komerční...
|
|
|
Srovnání fluorescenčních sond disC3(3) a diSC3(5) z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Matunová, Petra ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál představující napětí na membráně je důležitý parametr pro studium buněčných procesů. Pomocí karbocyaninových sond diS-C3(3) a diS-C3(5), označovaných společným názvem 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide, lze monitorovat změny membránového potenciálu buněk, které jsou příliš malé pro zavedení mikroelektrod. Tyto změny lze sledovat v jednotkách mV. Spektrální analýza buněčných suspenzí kvasinek S. cerevisiae s fluorescenčními sondami umožňuje stanovit koncentrace extracelulárního a intracelulárního fluorescenčního barviva, z jejichž znalosti lze určit hodnoty změn membránového potenciálu, které je možné vyvolat vnějšími podněty. Součástí práce je porovnání akumulace obou fluorescenčních sond a také experimenty zacílené na sledování vlivu vybraných látek a jejich měnících se koncentrací na volnou a vázanou složku barviva.
|
|
|
Fluorescenční spektroskopie suspenzí kvasinek barvených calcofluorem.
Dostál, Marek ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent)
Název práce: Fluorescenční spektroskopie suspenzí kvasinek barvených calcofluorem Autor: Marek Dostál Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: prof. RNDr. Jaromír Plášek CSc. Abstrakt: V této práci jsme hledali a nalezli jednoduchou a rychlou metodu, která využívá fluorescenční spektroskopii ke zkoumání a porovnávání kvality buněčných stěn různých rodů kvasinek, pěstovaných při vysoké a nízké koncentraci glukózy v růstovém médiu a měřených v rozpouštědlech o různých iontových silách. Na kvalitu buněčné stěny kvasinek má největší vliv právě růstové médium. Jako fluorescenční barvivo jsme použili calcofluor, který při excitaci UV zářením λex≈365nm modře fluoreskuje s maximem v okolí λem≈420nm v závislosti na jeho koncentraci v suspenzi. Při zkoumání spekter calcofluoru jsme se museli vyvarovat vnitřnímu filtru suspenze, který může značnou mírou ovlivňovat výsledky měření. Podařilo se nám potvrdit platnost podílové metody jakožto ukazatele umožňující pomocí podílových spekter charakterizovat odlišnou strukturu buněčné stěny u různých kmenů kvasinek (spectral fingerprint). Klíčová slova: Fluorescence, spektroskopie, buněčná stěna, calcofluor, vnitřní filtr.
|
|
|
Atomic Force Microscopy a vizualizace rozdílů ve struktuře buněčných stěn mladých a starých kvasinek S. cerevisiae.
Schwarzová, Tereza ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Shukurov, Andrey (oponent)
Cílem práce bylo zobrazit metodou mikroskopie atomárních sil (AFM) rozdíly ve struktuře buněčných stěn mladých a starých kvasinek S. cerevisiae a zjistit, jaký vliv na buněčnou stěnu má koncentrace glukózy v živném médiu. AFM je založena na měření sil mezi povrchem zkoumaného vzorku a hrotem, který povrch rastruje. Tato metoda umožňuje zkoumat buněčnou stěnu kvasinek v jejich přirozeném prostředí - ve vodě, přičemž lze zobrazit detaily o rozměrech řádově desítek nanometrů. Použity byly kvasinky kmenů AD 1-3,IL,US stejného stáří a kmenů JC 482A (označovány jako #013) a AD-JC 488A (označovány jako #015) staré jeden, dva a pět dní. Podařilo se nasnímat mnoho kvalitních obrázků srovnatelných s nejlepšími AFM snímky publikovanými v textech zabývajících se touto problematikou. Zejména se povedly detailně zobrazit oblasti jizev, které vznikají na povrchu kvasinek při jejich pučení a následném oddělení dceřinné buňky. Měření prokázalo výrazné změny buněčné stěny kvasinky v průběhu stárnutí (zvrásnění, zhrubnutí struktury). Vliv glukózy na strukturu buněčné stěny nebyl prokázán. Výsledky tohoto měření mohou být podkladem k dalšímu zkoumání buněčné stěny kvasinek metodou.
|
|
|
Měření membránového potenciálu pomocí iontově-selektivních elektrod citlivých na tetrafenylfosfóniový kation
Lábajová, Anna ; Kofránek, Jiří (vedoucí práce) ; Sigler, Karel (oponent) ; Plášek, Jaromír (oponent)
SOUHRN 102 SOUHRN Byla zkonstruována aparatura na měření membránového potenciálu, která využívá iontově-selektivní elektrody citlivé na tetrafenylfosfóniový kationt (TPP+ ). Aparatura byla připojena k počítači a sběr, zpracování a ukládání dat bylo uskutečněno programem MATLAB/Simulink. Složení TPP+ -selektivní membrány bylo optimalizováno zabudováním sraženiny TPP+ TPB- do membrány, čím se dosáhla Nernstovská dopověď od koncentrace 3.10-6 M TPP+ . Protože docházelo k vyplavování TPP+ z membrány do média, TPP+ TPB- bylo nahrazeno tetrakis[3,5-bis(1,1,1,3,3,3- hexafluoro-2-methoxy-2-propyl)fenyl]boritanem sodným (NaHFPB). Elektrody s NaHFPB měly Nernstovskou odezvu od 1. 10-6 M TPP+ a tím byla dosažena větší citlivost oproti komerčně vyráběným elektrodám. Byly vypočteny koeficienty selektivity pro K+ , Na+ , Ca2+ a Mg2+ . Aparatura byla použita pro monitorování mitochondriálního membránového potenciálu izolovaných mitochondrií a pro sledování funkce dýchacího řetězce mitochondrií v buňkách s permeabilizovanou plasmatickou membránou (hepatocytů, BSC-40, HeLa G, cybridů) pomocí nízké koncentrace digitoninu. Tato metoda byla použita i pro sledování funkce "mitochondrial permeability transition pore" (MPTP) jak u izolovaných mitochondrií, tak u permeabilzovaných hepatocytů. Otevření MPTP bylo indukováno vysokou...
|
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.