|
|
Charakterizace promotorových oblastí genů HGSNAT a GBA, a příspěvek ke studiu patogeneze MPS IIIC a Gaucherovy choroby
Richtrová, Eva ; Hřebíček, Martin (vedoucí práce) ; Macek, Milan (oponent) ; Adam, Tomáš (oponent)
Patogeneze mukopolysacharidózy IIIC (MPS IIIC) a Gaucherovy choroby nebyla na molekulární úrovni doposud zcela objasněna, stejně jako nejsou známy důvody pro výrazně rozdílné fenotypové projevy u pacientů nesoucích stejný genotyp. Protože varianty v regulačních oblastech genů mohou být příčinou výše zmíněné fenotypové variability, zabývala jsem se studiem doposud necharakterizovaných promotorových oblastí genů HGSNAT a GBA, které jsou mutovány u těchto dvou lysosomálních onemocnění. Prokázala jsem existenci alternativního promotoru genu GBA (P2) a dále se zabývala studiemi, které by mohly objasnit jeho fyziologickou funkci a případně i roli při patogenezi Gaucherovy choroby. Zjistila jsem, že alternativní promotor genu GBA není tkáňově specifický a nevede k variabilní expresi mRNA pro glukocerebrosidázu u pacientů se stejným genotypem a výrazně odlišnými fenotypovými projevy. P2 není různě využíván během diferenciace monocytů na makrofágy, ani u makrofágů odvozených od kontrolních osob a od pacientů s Gaucherovou chorobou, u kterých je střádání přítomno hlavně v buňkách makrofágového původu. Nepodařilo se tedy nalézt změny svědčící pro možnou úlohu P2 v patogenezi nemoci. Dále jsem charakterizovala promotorovou oblast genu HGSNAT a prokázala jsem, že vazba transkripčního faktoru Sp1 je důležitá pro...
|
|
|
Molekulární syndromologie: molekulárně genetické příčiny vzácných onemocnění na příkladu Kabuki a Kabuki-like syndromů
Paděrová, Jana ; Macek, Milan (vedoucí práce) ; Baxová, Alice (oponent) ; Fajkusová, Lenka (oponent)
Kabuki syndrom (KS) je dominantně dědičné onemocnění způsobené většinou de novo patogenními mutacemi v genech KMT2D (dříve MLL2) nebo KDM6A. Jedná se o vzácné multisystémové onemocnění charakterizované především intelektovou nedostatečností (ID - "intellectual disability") a typickou obličejovou dysmorfií. KS je klinicky velmi heterogenní, což znesnadňuje jeho klinickou diagnostiku. Prvním cílem této dizertační práce bylo zavedení testování patogenních mutací ve dvou známých KS kauzálních genech metodou Sangerova DNA sekvenování a následně metodou MLPA (Multiple Ligation Probe Amplification) na pracovišti Ústavu biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol a následně pak identifikace mutací v genech KMT2D či KDM6A u reprezentativního souboru 43 pacientů s fenotypem typickým pro KS, kteří byli indikováni k tomuto molekulárně genetickému vyšetření z několika spolupracujících genetických ambulancí v České republice. Výsledkem této studie bylo potvrzení či vyvrácení klinické diagnózy pacienta, studium spektra mutací v genech KMT2D/KDM6A v české populaci, korelace fenotypu s genotypem a zhodnocení využití fenotypového "MLL2-skóre" (publikovaného Markrythanasisem et al., 2013) jakožto predikčního nástroje k selekci pacientů pro sekvenování genu KMT2D. U 40% (17/43) analyzovaných pacientů s KS...
|
|
|
Preimplantační genetická haplotypizace v geneticky rizikových rodinách
Borgulová, Irena ; Macek, Milan (vedoucí práce) ; Trávník, Pavel (oponent) ; Veselá, Kateřina (oponent)
PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÁ HAPLOTYPIZACE V GENETICKY RIZIKOVÝCH RODINÁCH Abstrakt disertační práce Ireny Borgulové Page 1/1 ABSTRAKT Preimplantační genetická diagnostika (PGD) je na pomezí asistované reprodukce a klinické genetiky. PGD přechází prenatální diagnostiku, protože spočívá v biopsii jedné embryonální buňky a jejím vyšetření k vyloučení genetických rizik ještě před transferem embrya zpátky do dělohy matky. Metody v rámci PGD mohou nabídnout celou škálu možných vyšetření jedné buňky, ať už zaměřených na monogenní choroby, aberace jednotlivých chromozomů či abnormality celého genomu. Monogenní nemoci u embryí mohou být detekovány přímou nebo nepřímou vazebnou analýzou. Nepřímá vazebná analýza má oproti přímé tu výhodu, že je schopna identifikovat případnou aberaci vyšetřovaného chromozomu. Nepřímá vazebná analýza je charakterizována preimplantační genetickou haplotypizací (PGH), která je primární a důležitou součástí PGD cyklu. PGH vychází z rodinné anamnézy, srovnáním haplotypů členů rodiny, k determinaci patologického/ vysokorizikového (vázající se s mutací) haplotypu a zdravého/ nízkorizikového (bez mutace) haplotypu. PGD cyklus vyžaduje in vitro fertilizaci (IVF). IVF cyklus zahrnuje hormonální stimulaci, biopsii oocytů a jejich fertilizaci mimo tělo probandky, kultivaci embrya, biopsii...
|
|
| |
|
|
Využití sekvenačních metod nové generace pro objasnění fenotypu podobného CF u pacientů s nejasnou molekulární podstatou onemocnění.
Matějčková, Iva ; Macek, Milan (vedoucí práce) ; Holá, Dana (oponent)
Cystická fibróza (CF) je geneticky podmíněné, autozomálně recesivní onemocnění, které se vyskytuje s prevalencí v evropské populaci přibližně 1:2500 - 1:1800. U tohoto onemocnění dochází k mutaci v CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) genu s následnou poruchou chloridových kanálů. U takto postižených jedinců pozorujeme zejména chronické dýchací obtíže, pankreatickou insuficienci, vysokou koncentraci chloridových iontů v potu a obstruktivní azospermii. Genetické vyšetření CFTR genu je indikováno u jedinců, kteří splňují klinický obraz CF a mají pozitivní potní test (zvýšená koncentrace chloridů v potu). Genetické vyšetření CFTR genu se většinou provádí pomocí komerčních kitů detekujících nejčastější mutace CFTR genu na území České republiky. Při negativním nálezu je dále prováděna metoda MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), která zachycuje rozsáhlejší delece a duplikace v genu. V případě negativního nálezu se provádí sekvenace všech exonů CFTR genu. I přes velmi dobře zavedený algoritmus vyšetření zůstávají někteří pacienti trpící projevy CF bez objasnění příčiny jejich onemocnění na genetické úrovni. Díky rozvoji sekvenování nové generace je možné diagnostiku CF zefektivnit a odhalit varianty, které nebyly zachyceny předešlými metodami.
|
|
|
Regulation of cell cycle and DNA damage response in mouse oocytes.
Mayer, Alexandra ; Šolc, Petr (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Macek, Milan (oponent)
Buněčný cyklus savčích oocytů je dočasně zastaven v průběhu profáze I. meiotického dělení a v tomto stádiu mohou oocyty přetrvávat až několik desítek let. V oocytech proto musí fungovat účinné mechanismy, které je udržují v profázi I a umožňují znovuzahájení meiózy, když je potřeba. Následně, správná segregace chromozomů během maturace oocytů je podmínkou pro vývoj zdravých potomků. Naším cílem bylo zjistit nové role AURKA a PLK1 kináz v regulaci buněčného cyklu. Použili jsme transgenní myši, které nadprodukují wild type (WT-) nebo neaktivní (kinase- dead, KD-) AURKA pouze v oocytech, a ke studiu PLK1 kinázy jsme použili specifický inhibitor BI2536, jehož účinnost je ověřená v somatických buňkách. Naše data ukazují, že jak AURKA tak PLK1 nejsou nezbytné pro znovuzahájení meiózy, i když obě kinázy se tohoto procesu účastní. Aktivní AURKA reguluje proces multiplikace mikrotubuly organizujících center (MTOC) v profázi I, což je první viditelná známka znovuzahajení meiózy. Aktivace AURKA je bifázní, proto primární nárůst počtu MTOC je tranzientní. Plná aktivace AURKA, která je potřebná pro stabilitu MTOC, vyžaduje aktivitu Cyklin-dependentní kinázy 1 (CDK1). Ukázali jsme, že PLK1 se účastní rozpadu jaderné membrány během znovuzahájení meiózy. Jak AURKA tak PLK1 se podílí na akumulaci centrozomálních...
|
|
|
Optimalizace novorozeneckého screeningu cystické fibrózy v České republice
Krulišová, Veronika ; Macek, Milan (vedoucí práce) ; Vrtěl, Radek (oponent) ; Hřebíček, Martin (oponent)
Univerzita Karlova v Praze 2. lékařská fakulta Autoreferát dizertační práce Optimalizace novorozeneckého screeningu cystické fibrózy v České republice MUDr. Veronika Krulišová Praha, 2014 2 Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Obor: Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie Předseda oborové rady: Prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc. Školicí pracoviště: Ústav biologie a lékařské genetiky 2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze a Fakultní nemocnice Motol Autor: MUDr. Veronika Krulišová Školitel: Prof. MUDr. Milan Macek jr., DrSc. Konzultant: Doc. MUDr. Felix Votava, Ph.D. Oponenti: Autoreferát byl rozeslán dne: Obhajoba se koná dne: ……………..v ………..hod. kde: …………………… S dizertační prací je možno se seznámit na děkanátu 2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze. 3 ABSTRAKT Novorozenecký screening cystické fibrózy umožňuje diagnostikovat pacienty s cystickou fibrózou v preklinickém stadiu nebo v době, kdy ještě nejsou klinické příznaky plně vyjádřeny. Na základě včasné diagnostiky pak mohou být pacienti s cystickou fibrózou léčeni již před vznikem ireverzibilních změn v organizmu, což významně prodlužuje a také zlepšuje kvalitu života. Komentovaná verze dizertační práce se zabývá problematikou výběru vhodného screeningového...
|
|
|
Detekce minimální reziduální choroby v kostní dřeni a periferní krvi u pacientek s karcinomem prsu.
Čabiňaková, Michaela ; Tesařová, Petra (vedoucí práce) ; Konopásek, Bohuslav (oponent) ; Macek, Milan (oponent)
Úvod: Výskyt diseminovaných nádorových buněk (DTCs) a cirkulujících nádorových buněk (CTCs) je spojen se špatnou prognózou a zvýšeným výskytem úmrtí v důsledku onemocnění u pacientek s nemetastatickým karcinomem prsu. Cílem dizertační práce bylo stanovit DTCs v kostní dřeni a CTCs v periferní krvi u pacientek s primárním karcinomem prsu, zhodnotit korelaci výskytu DTCs/CTCs s přítomností dalších prognostických markerů a monitorovat výskyt DTCs/CTCs v průběhu léčby. Metody: Do studie bylo zařazeno 50 pacientek s primárním karcinomem prsu. K analýze CTCs z periferní krve byla použita imunomagnetická separace a k jejich detekci byl použit diagnostický kit AdnaTest Breast Cancer™ (AdnaGen GmbH, Langenhagen, Německo). Detekce DTCs v kostní dřeni probíhala pomocí imunocytochemické analýzy s pomocí pancytokeratin protilátky konjugované s FITC (monoklonální anti-cytokeratin protilátka F3418, Sigma Aldrich, USA). Výsledky: DTCs jsme stanovili u 30% (15/50) a CTCs u 22% (11/50) pacientek. Studie potvrdila, že DTC pozitivita signifikantně korelovala s velikostí primárního nádoru (p- hodnota 0,011) a infiltrací lymfatických uzlin (p-hodnota 0,002). CTC pozitivita nekorelovala ani s velikostí nádoru či infiltrací axilárních uzlin. DTCs byly převážně detekovány u pacientek ER/PR negativních a HER-2 pozitivních....
|
|
|
Charakterizace promotorových oblastí genů HGSNAT a GBA, a příspěvek ke studiu patogeneze MPS IIIC a Gaucherovy choroby
Richtrová, Eva ; Hřebíček, Martin (vedoucí práce) ; Macek, Milan (oponent) ; Adam, Tomáš (oponent)
Patogeneze mukopolysacharidózy IIIC (MPS IIIC) a Gaucherovy choroby nebyla na molekulární úrovni doposud zcela objasněna, stejně jako nejsou známy důvody pro výrazně rozdílné fenotypové projevy u pacientů nesoucích stejný genotyp. Protože varianty v regulačních oblastech genů mohou být příčinou výše zmíněné fenotypové variability, zabývala jsem se studiem doposud necharakterizovaných promotorových oblastí genů HGSNAT a GBA, které jsou mutovány u těchto dvou lysosomálních onemocnění. Prokázala jsem existenci alternativního promotoru genu GBA (P2) a dále se zabývala studiemi, které by mohly objasnit jeho fyziologickou funkci a případně i roli při patogenezi Gaucherovy choroby. Zjistila jsem, že alternativní promotor genu GBA není tkáňově specifický a nevede k variabilní expresi mRNA pro glukocerebrosidázu u pacientů se stejným genotypem a výrazně odlišnými fenotypovými projevy. P2 není různě využíván během diferenciace monocytů na makrofágy, ani u makrofágů odvozených od kontrolních osob a od pacientů s Gaucherovou chorobou, u kterých je střádání přítomno hlavně v buňkách makrofágového původu. Nepodařilo se tedy nalézt změny svědčící pro možnou úlohu P2 v patogenezi nemoci. Dále jsem charakterizovala promotorovou oblast genu HGSNAT a prokázala jsem, že vazba transkripčního faktoru Sp1 je důležitá pro...
|
|
|
Zvýšení diagnostické efektivity QF-PCR pro vyšetření aneuploidií z plodové vody
Sedláková, Zdeňka ; Macek, Milan (vedoucí práce) ; Daňková, Pavlína (oponent)
Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF-PCR) je molekulárně genetická metoda založená na amplifikaci krátkých tandemových repetic (Short tandem repeats, STR) a měření výšek píků amplikonů na elektroforeogramu. V současné době je QF-PCR považována za spolehlivou, rychlou a levnou metodu nahrazující postupně běžné cytogenetické analýzy aneuploidií (vyšetření z dlouhodobých kultur buněk plodové vody). Přesto však v některých případech nelze pomocí QF-PCR určit parentální a meiotický původ aneuploidií. Cílem mé práce bylo ověřit nové dinukleotidové STR markery na chromozomech 13, 16, 18, 21 a 22. Dále zvýšit diagnostickou efektivitu QF-PCR zapojením dalších tetranukleotidových STR markerů na chromozomech 15, 16, 22 a zjistit populační a analytické charakteristiky těchto markerů. U všech dinukleotidových STR markerů se vyskytovaly ve větší míře stuttery, a proto nejsou vhodné pro účely rutinní diagnostiky. STR markery pro chromozomy 15, 16 a 22 byly ověřeny na 100 pacientech. Byly vybrány čtyři informativní markery pro chromozom 16, čtyři pro chromozom 22 a tři pro chromozom 15. V diplomové práci jsem tak rozšířila spektrum diagnostických STR markerů.
|
host ::
RSS.