|
|
Studium proteas virů Zika a Dengue
Novotný, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vondrášek, Jiří (oponent)
Zika a Dengue jsou flaviviry šířící se v lidských populacích obývající tropické oblasti skrze komáří mezihostitele. Flaviviry způsobují horečky, které se mohou v případě Dengue rozvinout až do život ohrožující hemorrhagické formy. Existuje možná souvislost mezi těhotnými ženami nakaženými virem Zika a zvýšeným rizikem vzniku mikrocefalie u novorozenců. Flavivirové horečky se v dnešní době léčí hlavně symptomaticky, nicméně je zde snaha o vývoj látek blokující životní cyklus virů a jejich šíření v organismu. Vhodným cílem takových látek jsou specifické virové enzymy, například flavivirová proteasa. Tato serinová proteasa chymotrypsinového typu je tvořena heterodimerem flavivirových nestrukturních proteinů NS2B a NS3. Doména NS3 obsahuje také helikasu, tu je však možné pro studii samotné proteasy rekombinantně odstranit. Protein NS2B je transmembránový, s doménou NS3 však interaguje pouze hydrofilní, 40 aminokyselinový peptid. Ten funguje jako chaperon a podílí se na vazbě substrátu v aktivním místě. V této práci bylo studováno šest variant rekombinantních proteinů obsahující aktivační peptid NS2B a proteasovou doménu NS3. Tyto proteiny byly exprimovány a purifikovány. Čtyři varianty byly charakterizovány v enzymologických studiích, včetně testování možných inhibitorů. Toto testování odhalilo...
|
|
|
Klonování, charakterisace a exprese mutantů lidské serinracemasy
Nováková, Ilona ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Brynda, Jiří (oponent)
AAbbssttrraakktt Lidská serinracemasa (hSR) je cytosolický enzym využívající pyridoxal-5'-fosfát, který je lokalizován v centrální nervové soustavě. Syntetizuje D-serin, aminokyselinu, jež je endogenním koagonistou N-methyl-D-aspartátových (NMDA) receptorů a hraje tak v mozku klíčovou roli v excitační neurotransmisi. Lidská serinracemasa je tudíž slibným cílem při léčbě neurodegenerativních onemocněních spojených s NMDA receptory. Zatím však bylo identifikováno jen málo specifických inhibitorů a krystalová struktura hSR byla vyřešena teprve nedávno. Rozhodli jsme se tedy pomocí náhodné mutageneze určit aminokyselinové zbytky klíčové pro aktivitu enzymu. O zbytku Ser 84 je známé, že se spolu s Lys 56 podílí na katalýze. Poté, co jsme analyzovali mutanta S84G/P111L lidské serinracemasy, který si zachovával schopnost konvertovat L-serin na pyruvát, jsme syntetizovali a charakterizovali mutantní hSR S84G, abychom mohli vyloučit případný vliv mutace P111L. KKllííččoovváá sslloovvaa:: D-serin; Serinracemasa; Enzymy závislé na PLP; Mutageneze; Racemasy
|
|
|
Charakterizace rekombinantní myší glutamátkarboxypeptidasy III
Janoušková, Karolína ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, PSMA, NAALADasa) je transmembránová metalopeptidasa a díky štěpení specifických substrátů β-citryl-L-glutamátu (BCG), N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamátu (NAAG) a polyglutamylovaných folátů (Pte-Glun) je studována jako potenciální terapeutický cíl. Enzymy, které by mohly kompenzovat enzymovou aktivitu a funkce GCPII, jsou proto rovněž relevantními cíli enzymologického výzkumu. Jedním z homologů GCPII s podobnou enzymovou aktivitou je glutamátkarboxypeptidasa III (GCPIII, NAALADasa II). U rekombinantní myší GCPIII ještě nebyly stanoveny kinetické parametry KM a kcat popisující její aktivitu. Myší GCPIII je důležité kineticky charakterizovat a porovnat s lidským ortologem, aby bylo zjištěno, jestli je enzymová aktivita tohoto enzymu v myším modelu srovnatelná se situací u člověka. Rekombinantní myší GCPIII byla kineticky charakterizována. Kinetické parametry rekombinantní myší GCPIII pro substráty NAAG a BCG byly změřeny metodou štěpení radioaktivně značeného substrátu. Kinetika reakce pro substrát Pte-Glu2 byla analyzována pomocí HPLC. Z hlediska štěpení NAAGu je lidská GCPIII účinnější než myší ortolog, v případě substrátu BCG jsou enzymy srovnatelné. Tyto výsledky nás posunou blíže k pochopení role GCPIII v nejpoužívanějším zvířecím modelu. Klíčová slova:...
|
|
|
Expression and characterisation of homologs of human glutamate carboxypeptidase II
Bäumlová, Adriana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Český abstrakt Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, EC 3.4.17.21) je membránové vázaný glykoprotein který patří do rodiny metalopeptidas M28. Pro tento enzym byly nalezeny dva fysiologické substráty. Prvním z nich je N-acetyl-aspartyl glutamát (NAAG), který slouží jako neurotransmiter v lidském mozku a GCPII při jeho štěpení produkuje volný glutamát do synapse. Nadbytečný glutamát může být cytotoxický a v důsledku vést k excitotoxické smrti nervových buněk. Bylo prokázáno, že inhibice této aktivity má neuroprotektivní účinek. Proto byla inhibice GCPII navržena jako možný terapeutický cíl při léčení neurologických chorob, ve kterých dochází k vytváření nadbytečného glutamátu. Druhým substrátem je polygamaglutamylfolát, je prekursorem kyseliny listové, která je nezbytná pro růst a vývoj buněk. GCPII odštěpuje glutamát z folátů v potravinách a tím usnadňuje jejich absorpci v tenkém střevu. Ačkoli je biologická role GCPII známa jen v mozku a tenkém střevu, prostata je další tkání, ve které GCPII hraje důležitou roli. GCPII byla popsána jako marker nádorů prostaty, protože se vyskytuje na membránách nádorových buněk. Jedná o transmembránový protein II. typu, navíc enzymově aktivní, který prochází internalizací: všechny tyto vlastnosti z něj vytvářejí velmi slibný nástroj pro specifickou protinádorovou terapii....
|
|
|
Sestřihové varianty genu GCPII a jejich role v nádorovém bujení
Jindrová, Helena ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Liberda, Jiří (oponent)
Alternativním sestřihem mRNA může vznikat z jediného eukaryotického genu několik různých proteinů s odlišnou sekvencí aminokyselin, strukturou, a tedy i funkcí. Tento jev je složitě regulován. Může hrát významnou roli v nádorovém bujení. Například u alternativního sestřihu osteopontinu byl prokázán jeho vliv na metastazování a progresi nádoru prsu. Glutamátkarboxypeptidasa II (též prostatický specifický membránový antigen) se vyskytuje ve zvýšeném množství ve zdravé i nádorové prostatické tkáni. Je známo několik jejích sestřihových variant. U některých z nich byla zkoumána souvislost mezi jejich přítomností a postupem karcinomu prostaty v pacientech pomocí kvantitativního RT-PCR. O expresi dalších sestřihových variant nejsou zatím k disposici žádné přesnější údaje. Mezi ně patří varianty s vynechaným exonem 6 anebo exonem 18. Cílem této práce bylo určit množství právě těchto delecí v několika biologických vzorcích. Za pomoci kvantitativní polymerasové řetězové reakce bylo stanoveno množství delecí exonu 6 a exonu 18 v cDNA kódující prostatický specifický membránový antigen ze vzorků tkání pacientů s benigní prostatickou hyperplazií, nádorem prostaty a z buněčné linie odvozené od karcinomu prostaty. Zároveň bylo stanoveno množství delecí v jednotlivých sestřihových variantách tohoto proteinu, které...
|
|
| |
|
|
Expression, characterisation and biological role of Ddi II, putative protein partner of proteasomal complex
Sivá, Monika ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Homeostáze vnitřního prostředí buňky je vysoce regulována souborem procesů, mezi které patří i degradace nežádoucích proteinů v buňce pomocí proteasom-ubikvitinového systému. Tento systém se skládá z řady navazujících dějů. Nejdřív je substrát díky specifickým enzymům posttranslačně označen ubikvitinem, následně je transportován a degradován v proteasomu. Rozpoznání substrátu proteasomem může být buď přímé díky proteasomálním receptorům nebo nepřímé pomocí tzv. přenosových proteinů. Tyto přenašeče vážou ubikvitinem označený substrát, který transportují k 19S podjednotce proteasomu. Po navázání se k 19 S proteasomu uvolní substrát do proteasomální kavity, kde je následně degradován. Funkce přenosových proteinů je podmíněna dvoudoménovým uspořádaním. Na N- terminálním konci je tzv. UBL doména "ubiquitin-like domain", která interaguje s proteasomem, a C-terminální konec se vyznačuje alespoň jedním ze skupiny motivů interagujících s ubikvitinem, který váže polyubikvitinový řetězec substrátu. Tato práce se zaměřuje na "DNA damage-inducible protein homolog 2" (Ddi2), protein, který pravděpodobně patří do této skupiny "přenašečů" v lidském organizmu, a na jeho případnou interakci s protesomální podjednotkou PSMD2. UBL doména lidského Ddi2 a protein PSMD2 byly rekombinantně připraveny v bakteriálním expresním...
|
|
|
Mass Spectrometry-Based Identification of a Potential Binding Partner of Glutamate Carboxypetidase II
Tužil, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Český abstrakt Systémová biologie bude vyžadovat použití nových metod s vysokou propustností dat pro studium protein-proteinových interakcí. Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii prošla v posledních letech rychlým vývojem a stala se nepostradatelným nástrojem studia makromolekul v základním i klinickém výzkumu. Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII; EC 3.5.17.21) je transmembránový protein se dvěma známými enzymovými aktivitami. Tento enzym je exprimován ve větším množství v buňkách některých pevných nádorů a také obecně v neovaskulatuře pevných nádorů, nehraje zde však fyziologickou roli. Některé skutečnosti mohou poukazovat na potenciální receptorovou funkci GCPII, přirozený ligand tohoto proteinu však nebyl doposud identifikován. Pro hledání možných vazebných partnerů a/nebo ligandů GCPII byly použity metody afinitní chromatografie, imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie. Byla optimalizována metodika přípravy vzorků pro hmotnostní spektrometrii a analýza získaných dat s cílem nalézt možné vazebné partnery. Jeden z identifikovaných proteinů- β-podjednotka F1 ATP-syntasy, byl vybrán pro důkladnější analýzu možné interakce s GCPII.
|
|
|
Trávicí proteasy termitů
Čermáková, Markéta ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Narozdíl od trávení celulosy nebyla u termitů dosud studována trávicí proteolýza, proto byly v diplomové práci analyzovány proteolytické enzymy trávicího traktu významných termitích škůdců Reticulitermes santonensis a Coptotermes formosanus (čeleď Rhinotermitidae). Pomocí panelu specifických substrátů a inhibitorů byly kvantifikovány a klasifikovány proteasy v jednotlivých kompartmentech střeva. Hlavní proteasy byly identifikovány ve středním střevě jako endogenní serinové proteasy trypsinového typu; v bachoru byly detekovány minoritní cysteinové proteasy, které jsou pravděpodobně produkovány symbiotickými organismy. Hlavní trypsinová proteasa termita R. santonensis (RsSP) byla chromatograficky izolována jako protein o 26 kDa a byla určena její N-koncová sekvence. S využitím selektivních proteasových inhibitorů byla prokázána fyziologická významnost trávicí trypsinové proteasy v testech in vivo s termitem C. formosanus. Na základě analýzy proteas u dalších 12 druhů termitů bylo navrženo obecné schéma trávicí proteolýzy u řádu Isoptera.
|
|
|
Prolylendopeptidasa z klíštěte Ixodes ricinus
Petrvalská, Olívia ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Klíšťata jsou významnými parazity a vektory patogenů. Na území České republiky je klíště obecné (Ixodes ricinus) nejrozšířenějším druhem, který přenáší lymskou boreliózu a klíšťovou encefalitidu. Proteasy klíšťat jsou potenciální molekulární cíle pro vývoj nových vakcín proti těmto parazitům. Tato práce se zaměřuje na biochemickou analýzu prolylendopeptidasy z klíštěte obecného, která dosud nebyla studována. Prolylendopeptidasa byla detekována v extraktu ze střevní tkáně klíštěte pomocí jednak měření enzymové aktivity a dále vizualizací na elektroforéze SDS-PAGE metodou fluorescenčního afinitního značení. Prolylendopeptidasa se pravděpodobně účastní procesu proteolytického trávení krevních proteinů, protože její specifická aktivita byla nejvyšší ve střevní tkáni a tato aktivita vzrůstala v průběhu procesu sání a zpracování potravy. Biochemická analýza ukázala, že enzymová aktivita prolylendopeptidasy je (1) závislá na volném cysteinovém zbytku v blízkosti aktivního místa, (2) optimální v oblasti pH 8-9, (3) selektivně inhibována peptidovými inhibitory Z-Ala-Pro-CMK a Z-Pro-Pro-CHO. Klíčová slova: prolylendopeptidasa, proteolýza, enzymová aktivita, substrátová specifita, klíště
|
host ::
RSS.