|
|
Charakterizace pankreatických beta-buněk po jejich stimulované proliferaci syntetickými modifikovanými mRNA
Veľasová, Adriana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Diabetes mellitus je chronické onemocnění způsobené ztrátou beta-buněk slinivky břišní, ke které dochází v důsledku autoimunitní destrukce, či zvýšené apoptózy beta-buněk. Nedostatek beta-buněk má za následek sníženou produkci insulinu, který hraje významnou roli v metabolismu glukosy. Počet beta-buněk organismu je jedním z hlavních faktorů, který ovlivňuje vznik tohoto chronického onemocnění. Z tohoto důvodu bylo vhodné nalézt způsob, pomocí kterého by bylo možné počet beta-buněk organismu navýšit a obnovit tak přirozenou cestou produkci insulinu bez jakékoliv nutnosti využívání insulinových infuzí. Schopnost buněčného dělení beta-buněk ovšem s věkem klesá a v dospělosti je prakticky nulová. Nadějnou cestou k obnově insulin produkující tkáně se tak jeví studium buněčného cyklu beta-buněk, především poté časných a pozdních cyklinů a cyklin dependentních kinas, které působí jako regulátory buněčného cyklu. S cílem zvýšit počet beta-buněk vstupujících do buněčného cyklu jsme se zaměřili na studium vlivu in vitro připravených (IVT) mRNA cyklinů typu D a cyklin dependentních kinas 4 a 6 na stimulaci buněčného dělení izolovaných beta-buněk. Zjistili jsme, že transfekce IVT mRNA pro cykliny typu D v kombinaci s cyklin dependentními kinasami 4 a 6 výrazně zvyšuje proliferaci beta-buněk uvězněných v klidové fázi...
|
|
|
Příprava syntetických modifikovaných messenger RNA genů kódující regulátory buněčného cyklu
Petroušek, Filip ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Vašková, Michaela (oponent)
Jedním z moderních léčebných postupů je aplikace in vitro transkribované mRNA do cílových buněk za účelem tvorby požadovaných proteinů. Zmíněná metoda se ukázala být daleko efektivnější než terapeutické podání již předem připravených proteinů, kde při jejich vpravení do organismu docházelo k denaturaci. Hlavní náplní této práce byla in vitro příprava mRNA, její následná trasfekce do buněk Langerhansových ostrůvků a detekce exprese cílových proteinů pomocí metody Western blot. Konktrétně se jednalo o proteiny z rodin cyklinů a cyklin dependentních kináz (CDK), které hrají významnou roli v regulaci buněčného cyklu. Celkem byla připravena mRNA pro 8 molekul, mezi které patřily nemutované formy cyklinů D1, D2 a D3 a cyklindependentní kináza 6, dále pak mutované verze cyklinů D1 T286AT288A, D2 T280A, D3 T283A a cyklin dependentní kináza 4 R24C. U cyklinů se jednalo o záměnu aminokyseliny threoninu za alanin. Tato záměna má za následek zpomalení degradace proteinu ve srovnání s přirozeně se vyskytující formou. Pro cyklin dependentní kinázu 4 záměna aminokyseliny argininu za cystein také spočívá ve zvýšení její stability in vivo. Připravená mRNA kódující uvedené regulátory buněčného cyklu byla transfekována do buněk Langerhansových ostrůvků izolovaných z potkaního pankreatu. Tato metoda by mohla v...
|
|
|
Stimulace proliferace beta-buněk pankreatu pomocí syntetických modifikovaných mRNA kódující geny regulátorů buněčného cyklu
Ivanovská, Dana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
je metabolické onemocnění, které se projevuje dlouhodobě zvýšenou krvi. Hyperglykémie je způsobena ztrátou pankreatických inzulín produkujících beta buněk. V případě diabetu mellitu II. typu bývá také spojena Z toho důvodu by náhrada nebo regenerace beta buněk pacientů. V současné době se vědecký výzkum zaměřuje stimulaci proliferace pankreatických beta buněk. potenciálně vhodné molekuly pro indukci proliferace beta buněk. Tyto proteiny řídí vstup buňky do buněčného cyklu. Cílem této bakalářské práce bylo ověřit možnost navození proliferace beta buněk prostřednictvím synteticky připravených mRNA cyklinů typu D syntetizovaných mRNA umožnuje krátkodobě zvýšenou expresi příslušných proteinů. Dále byly také využity mutované formy cyklinů D, které vyznačují vyšší stabilitou a tedy i delším poločasem života. Po transfekci sociovaných Langerhansových ostrůvků byla detekována přítomnost cyklinů typu D Cdk4/6 metodou nepřímé imunofluorescence. Současně byla také provedena metoda Western blotu s následnou imunodetekcí proteinů. Transfekce potkaních Langerhansových ostrůvků rů pro cykliny typu D s Cdk4/6 vedla ve všech případech k výrazné indukci proliferace potkaních beta buněk. Míra proliferace se pohybovala v rozmezí − kombinaci transfekovaných syntetických mRNA, kdežto u kontrolní netransfekovaných beta buněk byla...
|
|
|
Vliv dihydromyricetinu na metabolismus ethanolu
Skotnicová, Aneta ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Koblas, Tomáš (oponent)
Dihydromyricetin (DHM), též ampelopsin, je flavonoidní sloučenina vykazující široké spektrum pozitivních účinků na lidský organismus. Rostlinné výtažky obsahující tuto sloučeninu byly v tradiční čínské medicíně hojně využívány převážně pro své hepatoprotektivní vlastnosti. DHM též pomáhá při intoxikaci alkoholem a zmírňuje projevy kocoviny či abstinence. Vzhledem k tomu, že se dosud nepodařilo objasnit mechanismus účinků DHM na metabolismus ethanolu, byl proto v této diplomové práci studován vliv dihydromyricetinu na expresi a aktivitu alkoholdehydrogenasy (ADH), jednoho z nejdůležitějších enzymů zapojených do metabolismu ethanolu. Byly optimalizovány kultivační podmínky primárních hepatocytů izolovaných z nepremedikovaného a z ethanolem premedikovaného potkana vystavených působení EtOH a DHM. Při stanovení míry poškození buněk způsobené EtOH v přítomnosti DHM nebyl zjištěn žádný významný trend protektivního účinku DHM. Na druhou stranu byl technikou ELISA (stanovení alaninaminotransferasy) zaznamenán protektivní účinek ethanolu v hepatocytech kultivovaných v prostředí EtOH a DHM. Metodou Western blot s následnou imunodetekcí nebyla zjištěna indukce exprese ADH v hepatocytech. Dále nebyl zjištěn modulační vliv DHM na aktivitu ADH ve vzorcích hepatocytů ani na aktivitu purifikovaného enzymu. V...
|
|
| |
|
| |
|
|
Studium molekulární organizace systému cytochromu P450
Holý, Petr ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Koblas, Tomáš (oponent)
V metabolismu velkého množství endogenních látek i xenobiotik hraje zásadní roli systém oxygenas se smíšenou funkcí (MFO systém). Tento membránový systém je tvořen cytochromy P450, NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasou (CPR), cytochromem b5 a NADH:cytochrom b5 oxidoreduktasou (b5R). Cytochrom P450 katalyzuje monooxygenaci substrátu a CPR a cytochrom b5 představují jeho redoxní partnery. Cytochrom b5, jehož redoxním partnerem je b5R, ovlivňuje reakce katalyzované MFO systémem, a to ne zcela objasněným mechanismem. Tato práce se zabývá purifikací b5R a CPR z jater králíka domácího. Diferenční centrifugací bylo získáno 18 ml mikrosomální frakce o obsahu proteinů 42 mg/ml. Z prvního dílu mikrosomální frakce byla pomocí chromatografie na kolonách DEAE- Sepharosy, CM-Sepharosy a 5'-ADP agarosy izolována b5R s výtěžkem 0,3 % ferrikyanid- reduktasové aktivity a obsahující několik kontaminantů o molekulových hmotnostech 50-70 kDa. Při druhé purifikaci b5R byla použita kombinace chromatografie na koloně DEAE-Sepharosy s přímým napojením na kolonu 5'-ADP agarosy, z níž byla získána b5R s výtěžkem 10,9 % a obsahující rovněž několik kontaminantů v intervalu molekulových hmotností 50-70 kDa. Preparát redukoval cytochrom b5 v přítomnosti NADH. Při obou purifikacích byla rovněž získána CPR pomocí chromatografií na...
|
|
| |
|
|
Studium sekrečních granulí buněčných linií a tkání produkujících insulin.
Halušková, Petra ; Žáková, Lenka (vedoucí práce) ; Koblas, Tomáš (oponent)
Slinivka břišní (pankreas) je místem tvorby mnohých významných exokrinních a endokrinních látek, mezi které patří i insulin. Tento hormon je v těle tvořen téměř výhradně v specializovaných β-buňkách Langerhansových ostrůvků, kde je skladován v sekrečních granulích. β-buňky jsou plné těchto sekrečních váčků, čímž je umožněna rychlá reakce organismu na stimul glukosy. Správně upravený, zralý insulin se pravděpodobně vyskytuje v sekrečních granulích ve formě hexameru insulinu koordinovaném okolo dvou zinečnatých iontů. Adekvátní reakce β-buněk na zvýšenou hladinu glukosy v krvi a následná sekrece insulinu, jsou jedními z klíčových pochodů regulace metabolismu v těle. Při studiu tvorby insulinu, jeho účinků nebo procesu sekrece se mimo primárních buněk z pankreatických ostrůvků využívají jako biologický model permanentní pankreatické buněčné linie. Tato diplomová práce se zaměřila na buněčné linie INS-1E a BRIN-BD11. Zjišťovali jsme schopnost těchto buněk tvořit proinsulin a insulin a obsah jejich zinečnatých iontů, které mohou mít na tvorbu a zpracování insulinu velký vliv. Ve všech metodách, které jsme používali, jsme linie porovnávali navzájem a posléze také s β-buňkami potkaních Langerhansových ostrůvků. Také se nám podařilo izolovat insulinové sekreční granule ze všech tří používaných buněčných...
|
|
|
Development, characterization and use of anti-orphan cytochrome P450 antibodies
Hrdinová, Johana ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Koblas, Tomáš (oponent)
Cytochromy P450 jsou důležité enzymy účastnící se metabolických pochodů, které využívají exogenní i endogenní látky jako substráty pro různé enzymatické reakce. Tyto enzymy mohou také jako substrát využít prekarcinogeny a aktivovat je na karcinogeny, což může vést k rozvoji rakoviny. Některé chemopreventivní látky mohou zvyšovat aktivitu cytochromů P450, a tím i riziko rozvoje rakoviny. Proto je důležité věnovat náležitou pozornost studiu mechanismu účinku těchto enzymů a vlivu chemopreventivních sloučenin na jejich aktivitu. mRNA exprese většiny isoforem cytochromů P450 je pozorovatelná ve zdravých (netransformovaných) tkáních, například játrech, mozku, srdci, tlustém střevě, ledvinách či placentě. Přesto existuje několik cytochromů P450, jejichž mRNA jsou v netransformovaných tkáních exprimovány málo, zatímco jejich exprese v transformovaných tkáních je znatelně vyšší. Jedním z takovýchto enzymů je CYP2W1, který může být použit jako prognostický marker kolorektální rakoviny - proto je užitečné mít schopnost detekovat přítomnost tohoto enzymu v různých tkáních. Detekce cytochromů P450 může být dosaženo metodou Western blot. V této metodě je imunodetekce provedena s využitím specifických protilátek. Pro tyto účely jsou nejčastěji používány savčí protilátky (IgG), ale protilátky izolované z...
|
host ::
RSS.