|
|
Rozvoj techniky separace a identifikace glykopeptidů pomocí chromatografie a hmotnostní spektrometrie pro klinické účely
Petroušek, Filip ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Glykoproteiny se běžně vyskytují v organismech a hrají významnou roli jak za fyziologického, tak patologického stavu. U glykoproteinů se na jednom glykosylačním místě mohou vyskytovat odlišné glykany a změna glykosylace proteinů může být projevem onemocnění. Díky tomu mohou být využity glykoproteiny v diagnostice jako markery. Pro analýzu glykoproteinů se často využívá jejich naštěpení na glykopeptidy, které jsou poté identifikovány. Hojně používanou metodou pro studium glykopeptidů je kapalinová chromatofrafie propojená s hmotnostní spektrometrií a pro separaci glykopeptidů je možné použít hydrofilní interakční chromatografii (HILIC). Tento typ chromatografie umožňuje separovat glykopeptidy na základě vlastností jak peptidu, tak navázaného glykanu. Prvním cílem práce bylo určení míry vlivu náboje peptidové páteře glykopeptidů při jejich separaci na HILIC. Pro tento účel byly použity kolony: Penta-HILIC a HILIC-B. Penta-HILIC obsahuje polyhydroxylovou stacionární fázi, zatímco stacionární fáze HILIC-B je tvořena silikagelem modifikovaným kladně nabitými aminopropylovými skupinami. Na obou kolonách byly separovány glykopeptidy IgG1 a IgG2. Pro určení míry vlivu náboje a hydrofobicty při separaci na HILIC-B byla provedena propionylace a esterifikace, při kterých došlo k eliminaci náboje na nabitých...
|
|
|
Příprava syntetických modifikovaných messenger RNA genů kódující regulátory buněčného cyklu
Petroušek, Filip ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Vašková, Michaela (oponent)
Jedním z moderních léčebných postupů je aplikace in vitro transkribované mRNA do cílových buněk za účelem tvorby požadovaných proteinů. Zmíněná metoda se ukázala být daleko efektivnější než terapeutické podání již předem připravených proteinů, kde při jejich vpravení do organismu docházelo k denaturaci. Hlavní náplní této práce byla in vitro příprava mRNA, její následná trasfekce do buněk Langerhansových ostrůvků a detekce exprese cílových proteinů pomocí metody Western blot. Konktrétně se jednalo o proteiny z rodin cyklinů a cyklin dependentních kináz (CDK), které hrají významnou roli v regulaci buněčného cyklu. Celkem byla připravena mRNA pro 8 molekul, mezi které patřily nemutované formy cyklinů D1, D2 a D3 a cyklindependentní kináza 6, dále pak mutované verze cyklinů D1 T286AT288A, D2 T280A, D3 T283A a cyklin dependentní kináza 4 R24C. U cyklinů se jednalo o záměnu aminokyseliny threoninu za alanin. Tato záměna má za následek zpomalení degradace proteinu ve srovnání s přirozeně se vyskytující formou. Pro cyklin dependentní kinázu 4 záměna aminokyseliny argininu za cystein také spočívá ve zvýšení její stability in vivo. Připravená mRNA kódující uvedené regulátory buněčného cyklu byla transfekována do buněk Langerhansových ostrůvků izolovaných z potkaního pankreatu. Tato metoda by mohla v...
|
host ::
RSS.