|
|
Heterologní exprese a purifikace potkaní formy cytochromu P450 1A1
Vlková, Michaela ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
Cytochrom P450 1A1 patří do "superrodiny" cytochromů P450 (CYP). Je to extrahepatální enzym, který se podílí na detoxikačním metabolismu mnoha xenobiotik, ale bohužel také zároveň patří mezi nejvýznamnější zástupce CYP účastnící se aktivace prokarcinogenů. Hlavním cílem této práce bylo pomocí heterologní exprese připravit a izolovat potkaní cytochrom P450 1A1 v dostatečném množství a čistotě. V rámci této práce byly připraveny dva vektory nesoucí gen pro potkaní cytochrom P450 1A1 vložené do účinného expresního plasmidu pCW. Funkčnost připravených vektorů byla ověřena expresí CYP1A1 a měřením CO diferenčních spekter. Zjistilo se, že pouze jeden z vektorů poskytoval nativní protein. Tento vektor byl transformován do buněk bakterií E.coli kmene DH5α, DH5α s vneseným plasmidem pHg1 a DH5α s vneseným plasmidem pGRO7. Byly testovány různé podmínky produkce CYP1A1: růstová média (LB a TB médium), čas produkce (24 a 48h), koncentrace IPTG (0,5mM a 1mM) a přítomnost ALA. Nejvyšší exprese bylo dosaženo v buňkách E.coli DH5α kultivovaných v modifikovaném TB médiu po 48 hodinách exprese a při teplotě 30řC (indukce při 0,6 - 0,8 OD600 0,5mM IPTG s přídavkem 0,5mM ALA). Úspěšně se podařilo exprimovat také CYP1A1 bez ALA za pomocí plasmidu pHg1, což velmi sníží ekonomické náklady celé produkce. Membrány buněk...
|
|
|
Příprava rekombinantního cytochromu P450 1A1
Dvořák, Martin ; Svášková, Dagmar (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
4 Abstrakt Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) je jednou z hlavních isoforem z celé "superrodiny" cytochromů P450 (CYP). Jedná se zejména o extrahepatální enzym, který se podílí na oxidaci mnoha polycyklických aromatických uhlovodíků a jiných xenobiotik. Vedle úlohy v detoxifikačním metabolismu je bohužel CYP1A1 také jeden z nejvýznamnějších CYP v aktivaci prokarcinogenů. Cílem této práce bylo připravit pomocí genové syntézy s optimalizací kodónů pro expresi v E. coli dvě různé varianty genu kódujícího potkaní CYP1A1, tj. "wild type" (wt1A1) a s pozměněnou N-terminální kotvou (mod1A1) (u obou pak modifikace s nebo bez His kotvy na C-konci), porovnat jejich expresi v různých typech buněk E. coli a případně se pokusit o purifikaci a srovnání enzymové aktivity genových produktů. Z navržených oligonukleotidů byly syntetizovány 2 "syntony" (části genu), vloženy samostatně do plasmidu pUC19, po ověření sekvence "vyštěpeny", spojeny a vloženy do expresního plasmidu pET-22b. Takto připravenými vektory byly transformovány 3 kmeny buněk E. coli, a to BL-21 (DE3) GOLD, RIL a RIPL. Byly testovány různé podmínky produkce požadovaných proteinů: teplota (18, 22, 24, 27 a 37 řC), čas produkce (až 48 hodin), koncentrace IPTG (0,1; 0,2; 0,5 a 1mM), OD600 při indukci (0,4; 0,6; 0,8; 0,9 a 1) a přidání ALA (0, 30, 60, 120 nebo 150...
|
|
| |
|
|
Syntéza 5'-UTR varianty PSM-E genu GCPII jako standardu pro RT-PCR
Růžičková, Barbora ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
V poslední době se pro chemickou syntézu genů stala klíčovým prvkem metoda PCR. V této práci byla využita dvoukroková syntéza DNA založená na PCR k získání 5'-UTR sestřihové varianty PSM-E glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) jako standardu pro qPCR v reálném čase. Dalším cílem práce bylo zaklonovat tuto sekvenci do plazmidu PCRII-TOPO PSM-E, aby mohla být použita k expresi proteinu v hmyzích buňkách v baculovirovém expresním systému. V první PCR reakci byl syntetizován střed sekvence 5'- UTR, který byl následně amplifikován v druhé PCR reakci pomocí prvního a posledního oligonukleotidu. Produkt druhé PCR reakce byl ligován do plasmidu pUC19 a tímto kostruktem byly transformovány bakterie E. coli. Správnost sekvence byla potvrzena sekvenční analýzou. Dále bylo provedeno subklonování insertu z pUC19 do pCRII-TOPO PSM-E a sekvence byla opět ověřena sekvenční analýzou. Získaný konstrukt byl použit jako standard v qPCR v reálném čase ke stanovení koncentrace vzorků mRNA z tkání prostat onkologických pacientů přepsaných reverzní transkripcí do cDNA. Z naměřených amplifikačních křivek standardu byla vytvořena kalibrační křivka, ze které byly odečteny hodnoty koncentrací vzorků cDNA.
|
|
|
Heterologní exprese lidské NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Mazurová, Martina ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
Se studiem karcinogenese přímo souvisí studium metabolismu xenobiotik, neboť ta se mohou na vzniku rakoviny podílet. Systém monooxygenas se smíšenou funkcí, který se na odbourávání cizorodých látek významně podílí, je v laboratoři, v níž byla práce prováděna, studován především pomocí experimentů in vitro. Pro získání potřebných rekombinantních enzymů se v současnosti hojně využívá metoda heterologní exprese. V této práci byla tato metoda použita pro přípravu lidské NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy, membránového enzymu, který redukuje cytochrom P450 a tím umožňuje jeho katalytickou aktivitu. Byly připraveny a ověřeny vektory, nesoucí syntetický gen pro lidskou NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasu, založené na plasmidech pUC19 a pET22b. Reduktasa byla produkována v buňkách E. coli BL21-Gold a E. coli BL21-CodonPlus-RIL. Celková produkce proteinu v buňkách byla vysoká, problémem však bylo, že vznikající protein byl přítomen převážně v inkluzních tělískách. Byly částečně optimalizovány podmínky exprese tak, aby zvětšil podíl nativního proteinu v bakteriální membránové frakci.
|
|
|
Příprava expresního systému gama-laktamázy a otestování exprese v E.coli
Magyerková, Monika ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
γ-laktamasa je enzym štěpící pětičlenné laktamové cykly. Jedním z jejích potenciálních substrátů je polyvinylpyrrolidon (PVP). Degradace PVP γ-laktamasou je zkoumána s ohledem na využití v čistírnách odpadních vod. Cílem této práce proto bylo připravit synteticky gen γ- laktamasy z bakterie Comamonas acidovorans a provést jeho klonování do expresního vektoru pET22b. Pro syntézu genu γ-laktamasy byla použita metoda PCA. Sekvence genu γ- laktamasy o délce 1725 bp byla rozdělena do dvou částí (syntonů), které byly syntetizovány samostatně. Po syntéze bylo provedno restrikční štěpení a ligace do vektoru pUC19. Takto připravenými konstrukty byly transformovány kompetentní buňky E. coli kmene DH5α. Po ověření správnosti sekvencí byly oba syntony vyštěpeny restrikčními endonukleasami a spojeny jednokrokovou ligací do plazmidu pET22b. Rekombinantním plazmidem obsahujícím spojené syntony byly transformovány expresní buňky E. coli kmene BL21(DE3)RIL a byla testována exprese rekombinantní γ-laktamasy. Sekvence klonu produkujícío protein odpovídající délky byla potvrzena sekvenční analýzou. Připravený expresní plazmid bude použit pro produkci rekombinantní γ-laktamasy. (In Czech)
|
|
|
Syntéza 5'-UTR varianty Var14 genu GCPII jako standardu pro RT-PCR
Petrovová, Gabriela ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cílem této práce bylo připravit syntetickou sekvenci 5'UTR sestřihové varianty Var 14 glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII). K tomu byla použita metoda dvoukrokové PCA. Sekvence byla rozdělena do 8 překrývajících se oligonukleotidů a spojena do jedné dsDNA pomocí dvou po sobě jdoucích PCR. Produkt syntézy byl zaklonován do pomocného vektoru pUC19. Po jeho osekvenování byly opraveny nalezené mutace. Produkt byl subklonován do cílového vektoru pcDNA4 His Var 14 již obsahujícího sekvenci vlastního genu GCPII. Tento konstrukt byl následně použit k sestrojení kalibrační křivky, která bude i nadále sloužit jako standard pro RT-PCR pro zjištění kvantity této varianty GCP II u pacientů s rakovinou prostaty. Konstrukt bude také používán jako expresní vektor pro produkci Var 14 varianty GCPII v eukaryontním baculovirovém expresním systému. Klíčová slova: 5'UTR, dvoukroková PCA, pUC19, RT-PCR, GCPII
|
|
| |
host ::
RSS.