|
|
Příprava expresního konstruktu a izolace xNEIL3 glykosylasy
Landová, Barbora ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
DNA glykosylasy jsou důležité proteiny sloužící k rozpoznání a odstranění poškození DNA, vznikající samovolně nebo působením environmentálních činidel. Do Fpg/Nei rodiny patří proteiny schopné rozpoznávat a přispět k opravě oxidované báze, abazického místa nebo kovalentního příčného spojení řetězců DNA pomocí zatím neobjasněné opravné dráhy. Bez opravy tohoto poškození nemůže docházet k replikaci a může vést k mutacím a rakovině. Tato práce se snaží přispět k objasnění molekulárních mechanismů interakce NEIL3 (Endonukleasa VIII - like 3) z rodiny proteinů Fpg/Nei se substrátrem - kovalentní spojení opačných řetězců DNA.
|
|
|
Selection approaches in directed evolution of binding proteins
Huličiak, Maroš ; Malý, Petr (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Umelo vytvárané väzobné proteíny odvodené od malých proteínových domén lákajú čoraz väčšiu pozornosť ako alternatívy k monoklonálnym protilátkam a majú široké spektrum využitia. Svoju aplikáciu si našli v oblastiach diagnostiky rôznych onemocnení, sú prísľubom pre vývoj vakcín proti globálnym ochoreniam ako je AIDS, môžu mať terapeutický potenciál a skvalitňujú purifikačné a chromatografické metódy. Na selekciu proteínových variánt, ktoré majú najlepšie väzobné vlastnosti sa v súčasnosti využíva viac než desať selekčných, tzv. displejových techník. Displejové techniky využívajú rôzne vektory pre vystavovanie proteínových variánt ako je tomu napríklad u fágového, kvasinkového, retrovirálneho či bakulovirálneho displeja. Selekcia taktiež môže prebiehať in vitro. Príkladom je ribozomálny displej, mRNA displej a CIS displej. Evolúcia displejových selekčných techník umožnila selekciu postranslačne glykosylovaných, fosforylovaných či acylovaných proteínov, prispela k zvyšovaniu výťažku selektovaných ligandov a k skvalitneniu ich väzobných vlastností. Práca popisuje a porovnáva vybrané selekčné metódy, pojednáva o výhodách a limitáciach ich kombinatoriálnych knižníc peptidov a uvádza praktické využitie väzobných proteínov odvodených od malých proteínových domén.
|
|
|
Vliv iontu Ca2+ na aktivitu lidské glutamátkarboxypeptidasy II.
Nedvědová, Jana ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Lidská glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, EC 3.4.17.24) je homodimerní membránový glykoprotein, který slouží jako marker rakoviny prostaty a rovněž jako terapeutický cíl léčby neurodegenerativních onemocnění. Extracelulární část GCPII je složená z apikální, proteasové a C-koncové domény. V aktivním místě jsou přítomny dva zinečnaté ionty nezbytné pro enzymatickou aktivitu. V blízkosti dimerizačního rozhraní je pak mezi apikální a proteasovou doménou koordinován ion Ca2+ , který je od aktivního místa vzdálen 20 Å, a tudíž se pravděpodobně přímo neúčastní hydrolýzy substrátů. Předkládaná práce si klade za cíl objasnit funkci iontu Ca2+ v molekule GCPII s využitím kombinace molekulárně- biologických, biochemických a biofyzikálních přístupů. Za tímto účelem jsme připravili sérii rekombinantních proteinů s bodovými mutacemi aminokyselin koordinujících Ca2+ ion. Mutantní proteiny byly exprimovány v hmyzích S2 buňkách a purifikovány pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie. Tyto proteiny vykazovaly výrazně sníženou enzymatickou aktivitu, nižší teplotní stabilitu a zvýšenou tendenci k tvorbě nefyziologických agregátů a naopak monomerní formy GCPII. Z výsledků tedy vyplývá, že ion Ca2+ hraje zásadní roli pro správné sbalování GCPII a rovněž pro tvorbu homodimerů, které jsou fyziologickou a hydrolyticky...
|
|
|
Bezbuněčná exprese proteinových knihoven z různých repertoárů aminokyselin
Neuwirthová, Tereza ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent)
Tato bakalá ská práce je úvodem do projektu zabývajícího se vlivem evoluce genetického kódu, tedy i v ase se m nícího repertoáru aminokyselin v proteinech, na vývoj struktury a funkce bílkovin. Prvotní aminokyselinová abeceda byla z ejm pouze polovi ní velikosti abecedy sou asné a zahrnovala podle dostupných analýz okolo 10 prebioticky p ítomných aminokyselin, pocházejících z exogenních i endogenních zdroj . Obsahem této práce je mRNA transkripce a bezbun ná exprese p ti randomizovaných proteinových knihoven (obsahujících zhruba 1011 variant). Uvedené knihovny se liší svým aminokyselinovým složením a odráží tak jednotlivé p edpokládané fáze evoluce genetického kódu. Hlavním cílem tedy je p evést knihovny z DNA formy do formy protein a poskytnout tak zdroj pro purifikaci knihoven a jejich následnou biofyzikální charakterizaci (výskyt sekundární a terciární struktury) a analýzy výskytu funkce v takto navržených knihovnách. Celý výzkum by tak teoreticky mohl p isp t k zodpov zení základních otázek nejen z oboru proteinové evoluce, ale i syntetické biologie i proteinového inženýrství. Klí ová slova: Bezbun ná exprese, proteiny, evoluce genetického kódu
|
|
|
Never Born Proteins: Occurence and characterization of secondary structure motifs
Treťjačenko, Vjačeslav ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Kopecký, Vladimír (oponent)
Studium náhodných proteinových sekvencí skýtá velký potenciál pro pochopení původu a mechanismu tvorby hydrofobního jádra a uspořádané struktury proteinů. V této práci byla provedena biofyzikální charakterizace pěti proteinových sekvencí bez homologie s dosud známými proteiny. Sekvence byly vybrány na základě bioinformatické analýzy, jenž spočívala ve vyhodnocení 10 0000 náhodných polypeptidových řetězců pomoci prediktorů sekundárních struktur, rozpustnosti a celkové proteinové neuspořádánosti. Charakterizace vedla k potvrzeni přítomnosti sekundárních struktur a v některých případech také k odhalení náznaků nativního uspořádání proteinů - tvorby stabilního hydrofobního jádra a tendenci k specifické oligomerizaci. Přestože uvedená práce je pouze součásti většího projektu, výsledky již teď naznačují, že náhodne proteinové sekvence mají potenciál k tvorbě sekundární i terciární struktury Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Exprese vaskulárního endotelového růstového faktoru a jeho využití v cévním tkáňovém inženýrství
Mikulová, Barbora ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Tato práce se zabývá expresí vaskulárního endotelového růstového faktoru (vascular endothelial growth factor, VEGF) a jeho využitím v tkáňovém inženýrství cévní stěny. V průběhu práce byla sledována interakce endotelových buněk s modifikovaným biomateriálem na bázi fibrinu, do kterého byl inkorporován růstový faktor cévního endotelu (VEGF-A121). Tato modifikace podpořila adhezi a růst endotelových buněk. Vaskulární endotelový růstový faktor VEGF-A121 je signální glykoprotein, který aktivuje transmembránové receptory na endotelových buňkách. VEGF-A121 je klíčovým regulátorem při vaskulogenezi, angiogenezi, proliferaci, migraci a přežití endotelových buněk. V rámci této práce byl tento protein heterologně exprimován s fúzním partnerem thioredoxinem v expresním systému E. coli Origami B (DE3). Rekombinantní VEGF-A121 byl navíc koexprimován s bakteriálními chaperony GroEL/GroES pro možné zvýšení jeho rozpustnosti a biologické aktivity. V další části této práce byla na povrchu polystyrenu katalytickým působením trombinu navázaným na adsorbovanou monovrstvu fibrinogenu připravena tenká fibrinová síť. Takováto síť byla dále obohacena o růstový faktor cévního endotelu (VEGF-A121), který do ní byl kovalentně inkorporován pomocí enzymové aktivity transglutaminasy (faktoru XIIIa). Poslední část je věnována...
|
|
|
Role iontů železa v metabolismu améby Naegleria gruberi
Ženíšková, Kateřina ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Železo je biogenní stopový prvek, jehož dostupnost je pro organismy životně důležitá. V biologických systémech se vyskytuje železo ve formě iontů Fe2+ a Fe3+ , které jsou většinou inkorporovány do struktury hemu nebo železo-sirných center. Proteiny obsahující železo mají v organismu širokou škálu působnosti, od přenosu elektronů v dýchacím řetězci (Rieskeho proteiny, cytochromy), přes podílení se na syntéze DNA (ribonukleotidreduktasy), až po účast v Krebsově cyklu (akonitasa a sukcinátdehydrogenasa). Naegleria gruberi je volně žijící améba, známá pro svou příbuznost s patogenní amébou Naegleria fowleri, způsobující primární améboidní meningoencefalitidu. Zajímavé je, že v jejím genomu jsou obsaženy geny pro aerobní i anaerobní metabolismus. V rámci této bakalářské práce byl zkoumán vliv dostupnosti iontů železa na metabolismus buněk Naegleria gruberi. Byly studovány změny aktivit enzymů vyskytujících se v různých metabolických drahách, a to u alkoholdehydrogenasy, glukokinasy, laktátdehydrogenasy, izocitrátdehydrogenasy, Fe-hydrogenasy, akonitasy a fumarasy. V závislosti na dostupnosti iontů železa byly zaznamenány největší změny u aktivit alkoholdehydrogenasy a hydrogenasy. Klíčová slova: železo, hem, železo-sirná centra, dostupnost iontů železa, Naegleria gruberi, metabolismus
|
|
|
Příprava a charakterizace nových proteinových sekvencí (never-born proteins)
Šimonová, Johana ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem náhodných polypeptidových sekvencí a výskytem sekundárních struktur v náhodném sekvenčním prostoru. Sekvence k experimentální charakterizaci byly vybrány z in silico knihovny obsahující 104 sekvencí na základě predikcí sekundárních struktur, rozpustnosti a proteinové neuspořádanosti anebo zcela náhodným výběrem. V předkládané práci je charakterizováno 8 bílkovin ze skupiny zcela náhodného výběru sekvencí výše popsané knihovny. Nejprve je charakterizována exprese a rozpustnost těchto bílkovin. Práce se dále zaměřuje na jeden vybraný protein, u kterého byla provedena optimalizace podmínek exprese, purifikace a následná podrobnější biofyzikální charakterizace. Klíčová slova: evoluce bílkovin, struktura bílkovin, náhodné sekvence
|
|
|
Komplementační peptid LacZ-alfa jako nástroj pro studium molekulární evoluce
Ptáčková, Barbora ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Proteiny jsou stavební a funkční podstatou všech živých organismů. Ačkoliv o jejich strukturních a funkčních vlastnostech dnes víme poměrně mnoho, jejich evoluce je pro nás stále nejasná. V současné době převažuje názor, že prvotní genetický kód obsahoval menší počet aminokyselin a postupem evoluce k němu byly přiřazovány aminokyseliny evolučně novější. Obecně uznávané teorie a studie předpokládají dva zdroje raných aminokyselin (exogenní a endogenní). Z rozsáhlého repertoáru prebioticky dostupných aminokyselin je v současnosti jen 10 geneticky kódovaných, tedy proteinogenních. Zbylých 10 proteinogenních (tedy evolučně novějších) aminokyselin zřejmě vzniklo až v důsledku evoluce biosyntetických drah. Otázkou zůstává, je-li raná polovina současných proteinogenních aminokyselin dostačující pro tvorbu strukturovaných a funkčních proteinů, které mohly dát vznik prvotnímu metabolismu. A je v současném světě možné nahradit evolučně novější aminokyseliny těmi ranými za současného udržení strukturně-funkční integrity? Právě tyto otázky tvoří základ předkládané práce. Cílem této práce bylo připravit metodiku pro mutagenezi zkráceného LacZ-alfa peptidu za účelem pozdějšího studia randomizace evolučně novějších aminokyselin za rané. Jako modelový protein byl vybrán LacZ-alfa peptid, který je v molekulární...
|
|
|
Příprava expresních vektorů pro NKp65 a KACL, nových zástupců rodiny lidských NK buněčných receptorů
Mikulová, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
NK buňky (natural killer cells, "přirození zabíječi") jsou významnou složkou vrozeného imunitního systému a mají schopnost rozpoznat a zabít především nádorové a virem infikované buňky. Na svém povrchu mají celou řadu inhibičních a aktivačních receptorů, pomocí kterých rozhodují o osudu cílových buněk. Imunitní odpověď je nejčastěji spuštěna po navázání NK buněčného receptoru na svůj ligand. Takovými receptor-ligandovými systémy jsou např. NKp80-AICL a NKRP1-LLT1 na lidských lymfocytech. Další receptor-ligandový pár představují NKp65 a KACL, dva nedávno objevené lektinové receptory lidských imunocytů. NKp65, blízký příbuzný NKp80, je glykoprotein, který funguje jako aktivační imunoreceptor na NK92MI buňkách. KACL je posledním objeveným členem lidské rodiny receptorů CLEC2 a je lokalizován téměř výhradně v kůži. Pomocí povrchové plazmonové rezonance bylo zjištěno, že NKp65 je vysokoafinitní receptor pro KACL. Cílem mé bakalářské práce bylo připravit expresní vektory kódující lidské NK buněčné receptory NKp65 a KACL, produkovat tyto proteiny v expresním systému HEK293T buněk a provést jejich purifikaci. Klíčová slova: NKp65, KACL, NK buňka, lektin, receptor, plazmid
|
host ::
RSS.