|
|
The crystal structure of PI4 kinase
Bäumlová, Adriana ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Fosfatidylinositol 4-kinázy (PI4K/PI4-kinázy) katalyzují produkci fosfatidylinositol 4- fosfátu (PtdIns4P), první krok v tvorbě vyšších fosfoinositidů. Fosfatidylinositol 4-fosfát je esenciálním prekurzorem pro tvorbu druhých poslů, fosfatidylinositol(1,4,5)trifosfátu a diacylglycerolu, které vznikají v signalizační dráze zahájené receptorem aktivovanou fosfolipázou C. Kromě toho fosfatidylinositol 4-fosfát reguluje procesy specificky se odehrávající v buněčných kompartmentech a to prostřednictvím vazby širokého spektra efektorových molekul na membránu. Jelikož PI4-kinázy mají ústřední pozici v tvorbě fosfatidylinositol 4-fosfátu probíhající na povrchu intracelulárních membrán, jsou tímto způsobem zodpovědné za procesy zprostředkované fosfatidylinositol 4-fosfátem jako například transport lipidů a jejich metabolizmus, transportní procesy v buňce a řízení transportovaného nákladu, remodelace membrán a cytoskeletu, přenos signálu do buňky a mnoho jiných. U savců byly identifikovány dva druhy PI4-kináz: typu II a typu III. Tyto typy kináz si nejsou sekvenčně podobné, a proto mají odlišné biochemické vlastnosti. Abychom objasnili strukturní příbuznost PI4-kináz, je zapotřebí strukturní analýzy. Strukturní charakterizace jednotlivých PI4-kináz by taktéž umožnila objasnit mechanizmus katalýzy vzniku...
|
|
|
Molekulární mechanismus regulace funkce neutrální trehalasy Nth1
Kopecká, Miroslava ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Pompach, Petr (oponent)
Enzym neutrální trehalasa (Nth1, EC 3.2.1.28), pocházející z kvasinek rodu Saccharomyces cerevisiae, pomáhá těmto organismům přežít v nepříznivých životních podmínkách. Nth1 hydrolyticky štěpí zásobní a ochranný disacharid trehalosu za vzniku dvou molekul glukosy. Aktivita enzymu Nth1 je regulována prostřednictvím fosforylace cAMP-dependentní proteinkinasou (PKA), následnou vazbou kvasničného proteinu 14-3-3 (Bmh1) a pomocí kationtů Ca2+ , které se váží na Ca-vazebnou doménu. Tato doména se nachází na N-konci Nth1 a obsahuje tzv. EF-hand motiv (D114 TDKNYQITIED125 ), který je konzervovaný mezi velkým množstvím Ca-vazebných proteinů. Hlavním cílem tohoto projektu bylo objasnění molekulární a strukturní podstaty mechanismu regulace aktivity Nth1 prostřednictvím vazby kationtů Ca2+ a proteinu Bmh1. Dalšími cíli bylo vyřešení struktury samotné Nth1 a jejího komplexu s Bmh1. Pro výzkum úlohy kationtů Ca2+ v regulaci aktivity Nth1 bylo připraveno dvanáct mutantních forem Nth1 s cílenými bodovými mutacemi v oblasti tzv. EF-hand motivu a jeho blízkém okolí a následně byla stanovena jejich aktivita v závislosti na přítomnosti Bmh1 a/nebo kationtů Ca2+ . Tvorba stabilních komplexů fosforylované pNth1 (včetně mutantních forem) s proteinem Bmh1 byla potvrzena pomocí nativní polyakrylamidové gelové...
|
|
|
Vývoj chemických regulátorů drah mikroRNA a RNAi
Bruštíková, Kateřina ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Pospíšek, Martin (oponent)
MikroRNA jsou nekódující RNA navozující sekvenčně specifickou inhibici genové exprese na posttranskripční úrovni. MikroRNA představují hlavní skupinu malých endogenních RNA v savčích buňkách. V současnosti je známo více než 2500 lidských mikroRNA, které potencionálně regulují více než 60% lidských genů kódujících proteiny. MikroRNA se účastní většiny buněčných procesů a změny v jejich expresi byly popsány u různých patologií, včetně rakoviny. V současnosti neexistuje žádná malá chemická sloučenina schopná efektivního ovlivnění aktivity dráhy mikroRNA. Nicméně, malé chemické sloučeniny představují skvělé nástroje pro výzkum procesů, ve kterých dráhy sekvenčně specifického umlčování RNA (RNA silencing) hrají roli. Navíc by mohly být využitelné i pro biotechnologické aplikace a mohly by mít i značný terapeutický potenciál. Tato práce je součástí širokého projektu, jehož konečným cílem je: (i) najít soubor malých molekul umožňujících stimulaci a inhibici drah sekvenčně specifického umlčování RNA a (ii) identifikovat případy, kdy se tyto dráhy vzájemně ovlivňují s jiných buněčnými drahami. Tato práce shrnuje výsledky prvních dvou fází projektu, vývoj vysoce výkonných metod testování s vysokou propustností a vysoce výkonné testování s vysokou propustností (high-throughput screening, HTS) dostupných...
|
|
|
Lidská glutamát karboxypeptidasa II a deriváty protilátek využitelné k její detekci
Bělousová, Nikola ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Rakovina prostaty je nejčastěji diagnostikované nádorové onemocnění mužů. V pokročilém stadiu je toto onemocnění velmi špatně léčitelné, a proto je včasná diagnostika prostatického nádorového bujení zásadní pro úspěšnou léčbu. Jedním z důležitých biomarkerů karcinomu prostaty je glutamát karboxypeptidasa II (GCPII). Úroveň exprese GCPII v prostatické tkáni se výrazně zvyšuje s progresí nádoru od benigní hyperplasie až po agresivní metastatickou formu. Cílem současného biomedicinálního výzkumu GCPII je vývoj terapeutických a diagnostických modalit založených buď na nízkomolekulárních sloučeninách nebo na makromolekulách specificky rozpoznávajících tento protein. Protilátky jsou preferovaným typem makromolekul využívaných v klinické praxi. Z důvodů lepší využitelnosti v biomedicínských aplikacích jsou nicméně přirozené protilátky obvykle modifikovány metodami proteinového inženýrství. Tato práce shrnuje současné poznatky o struktuře a funkci GCPII a o jeho využití jako biomarkeru rakoviny prostaty. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Impact of the glycine-rich loop on the function of processing peptidases of the mitochondrial type
Kučera, Tomáš ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Ettrich, Rüdiger (oponent)
SOUHRN Většina mitochondriálních proteinů je syntetizována na cytosolických ribozomech ve formě svých prekurzorů nesoucích signální sekvence, které umožňují jejich transport do mitochondrií. Jakmile proteinový prekurzor dosáhne mitochondriální matrix, signální sekvence již není potřeba a je odštěpena heterodimerní mitochondriální "processing" peptidasou (MPP; α/β). Ačkoli krystalová struktura MPP je známa, mechanismus funkce MPP je stále předmětem diskusí. Volná molekulárně-dynamická (MD) simulace byla použita k detailnímu studiu strukturních znaků glycinové smyčky (GRL) regulační α-podjednotky kvasinkové MPP. Struktury divoké a mutantní formy MPP s delecí celé glycinové smyčky byly studovány i v přítomnosti substrátu v aktivním místu peptidasy. Cílená MD simulace byla použita ke studiu mechanismu translokace substrátu z GRL do aktivního místa. Prokázali jsme, že přirozená konformační flexibilita GRL je zcela zásadní pro translokaci substrátu z okolního prostředí do aktivního místa peptidasy. Ukazujeme, že α-helikální konformace substrátu je důležitá nejen během jeho prvotního kontaktu s MPP (t.j. rozpoznání substrátu), ale také později, přinejmenším během prví třetiny translokační dráhy substrátu. Dále ukazujeme, že substrát zůstává v kontaktu s GRL během celé první třetiny translokace, během níž...
|
|
|
High-throughput screening for the discovery of small molecules modulating cell fate
Ribeiro Pombinho, António José ; Bartůněk, Petr (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Objevy sloučenin ovlivňujících buněčnou proliferaci, diferenciaci a smrt mohou vést nejen ke vzniku nových léčiv sloužících k léčbě či prevenci onemocnění, ale lze je také využít ke studiu molekulárních drah zapojených v těchto procesech. Pro testování tisíců těchto malých molekul v buněčných esejích je nezbytná přístrojová automatizace a miniaturizace. V této práci jsou popsány postupy testování s vysokou propustností (HTS). Jako hlavní předměty studia byly vybrány dráhy hypoxie a Wnt zapojené v růstu kmenových a nádorových buněk, diferenciace hematopoetických, neurálních a mesenchymálních kmenových buněk, a dráha TRAIL vedoucí k selektivní likvidaci nádorových buněk. Tímto postupem bylo možné testovat efekt malých molekul v eukaryotických buňkách a jednobuněčných organismech, jak je ilustrováno na příkladu hledání sloučenin účinkujících proti parazitickým prvokům rodu Leishmania. Několik sloučenin se ukázalo být aktivními modulátory osudu buňky. Jednalo se především o monensin, který inhibuje dráhu Wnt a zabraňuje růstu nádorů v myším modelu kolorektálního karcinomu, hemoharringtonin, který ve spolupráci s proteinem TRAIL indukuje smrt rakovinných buněk implantovaných do imunodeficientní myši, a diphenyleneiodonium chlorid, jenž zabíjí Leishmanie v buňkách. Žádná z těchto látek není v...
|
|
|
Studium úlohy proteinů 14-3-3 v regulaci G-proteinové signalizace
Řežábková, Lenka ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Fyzikální chemie Mgr. Lenka Řežábková Studium úlohy proteinů 14-3-3 v regulaci G-proteinové signalizace Role of the 14-3-3 proteins in the regulation of G-protein signaling Disertační práce Školitel: doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. Konzultanti: doc. RNDr. Petr Heřman, CSc. doc. RNDr. Jaroslav Večeř, CSc. Praha, 2012 Abstrakt Proteiny 14-3-3 skrze vazbu na více jak 300 rozličných, především fosforylovaných, proteinů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci svého Ph.D. studia jsem se zabývala úlohou proteinů 14-3-3 v regulaci G proteinové signalizace. Proteiny 14-3-3 ovlivňují G proteinovou dráhu skrze interakci s negativními regulátory G proteinové kaskády - proteiny RGS a fosducinem. Tato disertační práce si klade za cíl pomocí rozličných biochemických a biofyzikálních metod pochopit strukturní podstatu mechanismu, kterým fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 reguluje biologickou aktivitu a funkci proteinů RGS3 a fosducinu. Povedlo se mi vyřešit strukturu komplexu RGS3/14-3-3 s nízkým rozlišením, která ukazála, že RGS doména proteinu RGS3 interaguje s málo konzervovanou oblastí proteinu 14-3-3 nacházející se mimo centrální kanál. Tato struktura společně s...
|
|
|
Studium faktorů ovlivňující vazebnou specifitu 14-3-3 proteinů.
Veisová, Dana ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
111 10. Souhrn Proteiny 14-3-3 jsou dimerní molekuly s charakteristickým tvarem a velikostí okolo 30 kDa vyskytující se ve všech eukaryotických organismech. Zastávají klíčové role v rozmanitých buněčných procesech, jako jsou signalizace, buněčné dělení, apoptóza atd. C-koncový segment lidské isoformy proteinu 14-3-3ζ zastává důležitou autoinhibiční úlohu, kdy se v nepřítomnosti vazebného partnera váže do vazebného žlábku tohoto proteinu, a tím zároveň brání vazbě nevhodných ligandů. Struktura C-koncového segmentu nebyla dosud identifikována v žádné z publikovaných krystalových struktur. Oblast C-koncového segmentu je, na rozdíl od helikální oblasti α1-α9, sekvenčně vysoce variabilní. Usuzuje se, že C- koncový segment je velmi flexibilní a může zaujímat řadu různých konformací. Kvasničné isoformy proteinů 14-3-3 Bmh1 a Bmh2 se vyznačují významně delším C-koncovým segmentem s neznámou funkcí obsahující polyglutaminové sekvence. Úloha C-koncových částí kvasničných proteinů Bmh1 a Bmh2 byla prostudována rozmanitými biofyzikálními technikami. Měření dynamického rozptylu světla, sedimentační rychlosti, časově rozlišeného dohasínání anizotropie fluorescence a gelové permeační chromatografie naznačují zdánlivou, významně větší velikost molekul proteinů Bmh1 a Bmh2 v porovnání s lidskou isoformou 14-3-3ζ. Z tohoto...
|
|
|
Structure and function of C-type lectin NK cell receptors studied by recombinant expression and protein crystallography
Vaněk, Ondřej ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze 2010 Struktura a funkce C-lektinových receptorů NK buněk studovaná pomocí rekombinantní exprese a proteinové krystalografie Abstrakt dizertační práce Ondřej Vaněk Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. NK buňky (přirození zabíječi) byly popsány pro jejich schopnost spontánně zabíjet určité allogenní nádorové linie, a to bez jakékoliv předchozí senzitizace. NK buňky jsou součástí neadaptivní imunitní odpovědi s velmi krátkou reakční dobou vůči patogenům, jakými jsou například viry, intracelulární bakterie a parazité. Jsou také zodpovědné za eliminaci některých rakovinných buněk a mohou tak bránit rozvoji nádorové transformace a bojovat proti rozšiřování metastáz. Aktivita NK buněk je regulována pomocí rovnováhy mezi aktivačními a inhibičními signály zprostředkovanými povrchovými receptory NK buněk. Ze strukturního hlediska může být většina NK buněčných povrchových receptorů klasifikována jako C- lektinové nebo imunoglobulinové receptory. Jednou z mnoha podskupin C-lektinů jsou i lymfocytární receptory II. typu, které jsou exprimovány na NK buňkách. Předkládaná práce měla dva hlavní cíle. Prvním bylo nalezení vhodných expresních a purifikačních systémů pro vybrané C-lektinové receptory NK buněk a druhým pak provést jejich biochemickou a...
|
|
| |
host ::
RSS.