|
|
The crystal structure of PI4 kinase
Bäumlová, Adriana ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Fosfatidylinositol 4-kinázy (PI4K/PI4-kinázy) katalyzují produkci fosfatidylinositol 4- fosfátu (PtdIns4P), první krok v tvorbě vyšších fosfoinositidů. Fosfatidylinositol 4-fosfát je esenciálním prekurzorem pro tvorbu druhých poslů, fosfatidylinositol(1,4,5)trifosfátu a diacylglycerolu, které vznikají v signalizační dráze zahájené receptorem aktivovanou fosfolipázou C. Kromě toho fosfatidylinositol 4-fosfát reguluje procesy specificky se odehrávající v buněčných kompartmentech a to prostřednictvím vazby širokého spektra efektorových molekul na membránu. Jelikož PI4-kinázy mají ústřední pozici v tvorbě fosfatidylinositol 4-fosfátu probíhající na povrchu intracelulárních membrán, jsou tímto způsobem zodpovědné za procesy zprostředkované fosfatidylinositol 4-fosfátem jako například transport lipidů a jejich metabolizmus, transportní procesy v buňce a řízení transportovaného nákladu, remodelace membrán a cytoskeletu, přenos signálu do buňky a mnoho jiných. U savců byly identifikovány dva druhy PI4-kináz: typu II a typu III. Tyto typy kináz si nejsou sekvenčně podobné, a proto mají odlišné biochemické vlastnosti. Abychom objasnili strukturní příbuznost PI4-kináz, je zapotřebí strukturní analýzy. Strukturní charakterizace jednotlivých PI4-kináz by taktéž umožnila objasnit mechanizmus katalýzy vzniku...
|
|
|
Deciphering the biological role of Ddi1-like protein family
Sivá, Monika ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Stopka, Pavel (oponent)
Představitelé rodiny proteinů podobných Ddi1 (z angl. DNA damage-inducible protein homolog 1) patří do skupiny tzv. "přenašečů", které jsou v buňce zodpovědné za regulaci degradace proteinů v ubikvitin-proteasomálním systému. Proteiny podobné Ddi1 se od ostatních přenašečů liší specifickou doménou podobnou retrovirálním proteasam, která patří mezi aspartové proteasy. Nedávno byla v jejich struktuře taktéž objevena vysoce konservovaná helikální doména. V poslední době se objevují studie, které popisují nové funkce členů rodiny protein podobných Ddi1 a to v rámci udržování buněčné homeostázy v odpovědi na stresové podněty, např. v reakci na proteotoxické podmínky nebo v opravě poškozené DNA. Tato disertační práce se zabývá charakterizací vybraných členů rodiny proteinů podobných Ddi1 a to jak na molekulární úrovni, tak v biologických studiích na myších modelech. Byla vyřešena struktura domény podobné ubikvitinu (ubiquitin-like domain, UBL) v rámci kvasinkového proteinu Ddi1. Následně byly porovnány vazebné vlastnosti domén UBL kvasinkového proteinu Ddi1 a lidského proteinu DDI2. Doména UBL a motiv vázající ubikvitin (ubiquitin interacting motif, UIM) lidského homologu DDI2 sice specificky vážou ubikvitin, zároveň je však tato vazba velice slabáv porovnání s jinými ubikvitin vazebnými doménami. Naše...
|
|
|
Structure-assisted development of a continuous carboxypeptidase assay
Rakhimbekova, Anastasia ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Glutamát karboxypeptidasa II (GCPII) je zinek-dependentní karboxypeptidasa s vysokou hladinou exprese u karcinomu prostaty. Vzhledem k tomu, že daný enzym představuje ověřený cíl pro terapii a zobrazování rakoviny, je vývoj nových ligandů specifických pro GCPII stále předmětem aktivního akademického a průmyslového výzkumu. Stávající analýzy pro screening knihoven inhibitorů a stanovení účinnosti inhibitorů nejsou však optimální. Tato diplomová práce je zaměřena na vývoj malých interně zhášených sond, které by mohly být použity pro kontinuální měření enzymatické aktivity GCPII. Tyto sondy jsou odvozeny z přirozených substrátů GCPII a sestávají z páru fluorofor/zhášeč spojeného GCPII- hydrolyzovatelným linkerem. Nejprve jsem charakterizovala biofyzikální vlastnosti sond a poté stanovila kinetické parametry jejich hydrolýzy GCPII. Optimalizovaná metoda pro stanovení karboxypeptidasové aktivity byla použita pro určení IC50 u několika GCPII-specifických inhibitorů. Nakonec komplexy mezi neaktivním enzymem a uvedenými sondami byly kokrystalizovány, a pro jeden z komplexů byly provedeny upřesnění a analýza struktury. Naše data naznačují, že sondy jsou zapojeny do nekovalentních interakcí se stejnými aminokyselinovými zbytky aktivního místa enzymu jako přirozené substráty. Vyvinutá analýza může být...
|
|
|
Využití metody phage display při zkoumání povrchových antigenů Leishmania mexicana
Krylová, Anna ; Spitzová, Tatiana (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Leishmania je jednobuněčný parazit obratlovců přenášený krevsajícím hmyzem - flebotomy. U člověka způsobuje onemocnění zvané leishmanióza, které se řadí mezi nejzávažnější opomíjené tropické nemoci. V části životního cyklu leishmanie probíhající ve flebotomovi je z hlediska úspěšnosti vývoje parazita klíčový moment, kdy se bičíkatá stádia (promastigoti) přichycují na epitel mesenteronu flebotoma. U většiny druhů leishmanií není známo, na který receptor flebotoma se vážou, ani které povrchové antigeny k tomu využívají. Pomocí metody phage display byly hledány peptidové ligandy promastigotů Leishmania mexicana, které mohou hrát v této vazbě roli. Inkubací fágů s promastigoty a selekcí navázaných klonů fágů bylo identifikováno 16 unikátních peptidů. Fluorescenční značení fágů zobrazujících vybrané peptidy naznačilo potenciální místa jejich vazby na receptory leishmanií. Na základě hypotézy, že nalezené peptidy mohou představovat části domnělých receptorů mesenteronu flebotoma, byly provedeny experimenty, kde byli flebotomové infikováni promastigoty, jejichž vazebná místa byla zablokovaná navázanými fágy zobrazujícími dva vybrané peptidy. Intenzita infekce se lišila mezi oběma skupinami infikovaných flebotomů. Nebyla však pozorována statisticky významná odlišnost od kontrolní skupiny. Nepovedlo se sice popsat...
|
|
|
Molekulární podstata interakcí mezi Dishevelled 3 (DVL3) a proteinovým regulátorem cytokineze 1 (PRC1)
Kropáčková, Veronika ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent)
Scaffolding protein Dishevelled (Dvl) je klíčovou součástí Wnt signalizačních kaskád. Podílí se na řadě biologických procesů, kterými jsou například proliferace, diferenciace a migrace buněk, určování buněčné polarity a také obnova kmenových buněk. Je nepostradatelný pro správný vývoj embrya i tkáňovou homeostázu v dospělosti. Proteinový regulátor cytokineze (PRC1) patří mezi proteiny asociované s mikrotubuly. Podílí se na tvorbě centrálního svazku antiparalelních mikrotubulů (tzv. spindle midzone) v průběhu buněčného dělení, který předchází vzniku kontraktilního prstence a je nezbytný pro správný průběh cytokineze. V naší laboratoři byl PRC1 identifikován jako potenciální interakční partner DVL3. Tato diplomová práce je zaměřena na vymezení interakčního rozhraní mezi DVL3 a PRC1 s využitím TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopie. K tomuto účelu byly navrženy, exprimovány a purifikovány přirozeně se vyskytující formy DVL a PRC1 a jejich zkrácené varianty. Bylo zjištěno, že PRC1 interaguje se všemi izoformami DVL a pro interakci mezi PRC1 a DVL3 je nezbytná N-terminální část PRC1 a že na interakci se zřejmě podílí DEP doména DVL3. Klíčová slova: Dishevelled 3, DVL3, Proteinový regulátor cytokineze 1, PRC1, interakční rozhraní, TIRF mikroskopie
|
|
|
Substrátová specifita histondeacetylas
Ustinova, Kseniya ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Bumba, Ladislav (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Tubulin v buňce podléhá posttranslačním modifikacím, jež vytvářejí funkčně odlišné mikrotubuly a označují je pro specializované funkce. Jednou z takovýchto posttranslačních modifikací je acetylace Lys40 α-tubulinu, která je řízena aktivitou histondeacetylasy 6 (HDAC6). Acetylace Lys40 je charakteristickým znakem stabilních mikrotubulů. Chrání je před mechanickým stárnutím, ovlivňuje pohyblivost buněk, jakož i větvení axonů a stabilizaci dendritů. Tubulin vyniká jako nejvýznamnější fyziologický substrát pro HDAC6. HDAC6 je multidoménovým cytosolickým proteinem podílejícím se na nesčetných buněčných procesech a je slibným cílem léčby rakoviny a neurodegenerativních chorob. Pochopení mechanismů interakce HDAC6 s jeho substráty, zejména s tubulinem, může otevřít cestu pro vývoj nových léčebných strategií využívajících vysoce selektivní inhibitory HDAC6. V této práci jsme zkoumala molekulární podstatu jak HDAC6 rozpoznává tubulin. Naše detailní kinetická analýza ukazuje, že deacetylace volného tubulinu pomocí HDAC6 je 1500krát rychlejší než deacetylace mikrotubulů. Dále jsme ukázali, že na rozdíl od aminokyselin podílejících se na podélných a laterálních interakcích mezi tubulinovými dimery, aminokyseliny flexibilní smyčky obsahující Lys40 (s výjimkou míst P1 a P-1) příliš nepřispívají k rozpoznávání...
|
|
|
Membraneless organelles in eukaryotic cells
Beránková, Pavla ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Bezmembránové organely jsou nedávno popsaným typem buněčných kompartmentů. Jsou tvořeny molekulami proteinů a nukleových kyselin, které podstupují fázovou separaci kapalina-kapalina. Jsou schopné plnit jedinečné biologické úlohy, protože jsou vysoce dynamické a jejich složení může být efektivně regulováno. Poznatků o charakteru a funkci těchto útvarů v poslední době rychle přibývá. Práce shrnuje základní principy fázové separace kapalina-kapalina v živých organismech a dále se zaměřuje na několik typů bezmembránových organel funkčně spojených s mikrotubuly. Jejich opakující se vlastností je schopnost nukleace mikrotubulů. Tato role je zároveň ve shodě s jejich vysokou časovou a prostorovou dynamikou.
|
|
|
Bezmembránové buněčné organely - funkce a metody studia
Bašta, Miroslav ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Humhalová, Tereza (oponent)
Bezmembránové organely, také nazývané jako biomolekulární kondenzáty nebo proteinové kapénky, jsou kapalné, sférické útvary tvořící se ve všech buněčných kompartmentech se složením jen o málo odlišným od svého okolí. Obsahují zpravidla stovky různých typů proteinů a nukleových kyselin a plní v buňce mnoho významných funkcí. Vznikají procesem zvaným fázová separace dvou kapalin, kdy se v roztoku vytvoří fázové rozhraní za účelem snížení celkové volné energie systému. Takový proces může být iniciován vnějším stresem, vnitřními procesy buňky nebo mutacemi v DNA. Existuje mnoho známých typů bezmembránových organel a každým rokem přibývají další. Jejich funkce zahrnují především lokalizaci jednotlivých makromolekul a biochemických reakcí s nimi spojených, regulaci biochemických reakcí a transport makromolekul v buňce. Tato práce představuje stručné shrnutí tématiky bezmembránových organel s několika konkrétními příklady a velmi stručně popisuje několik vybraných metod jejich studia.
|
|
|
Investigation and inhibition of α-synuclein aggregation
Afitska, Kseniia ; Yushchenko, Dmytro (vedoucí práce) ; Žídek, Lukáš (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Alfa-synuklein (AS) je malý, vnitřně neuspořádaný protein exprimovaný v neuronech a hojně přítomný v synapsích, kde se podílí na regulaci transportu proteinů zprostředkovaném synaptickými vezikuly. Chybné poskládání AS do amyloidních fibril je klíčovým procesem v progresi Parkinsonovy choroby (PD), druhé nejběžnější neurodegenerativní nemoci, která je dosud neléčitelná. Inhibice agregace AS a blokování šíření těchto fibril z buňky do buňky je slibná strategie pro léčbu PD. Racionální design těchto inhibitorů však zůstává komplikovaný vzhledem k nedostatku detailních znalostí o mechanismech agregace. Cílem této práce bylo proto získat hlubší znalosti o agregaci AS a aplikovat je na vývoj inhibitorů fibrilizace. Při studiu mechanismů agregace AS jsem nejprve zjistila, že kritická koncentrace AS pro růst fibril je o řád nižší než kritická koncentrace AS pro počáteční tvorbu fibril z monomerů. Zkoumala jsem rozpad fibril při koncentracích nižších než Kd a charakterizovala jsem agregaci AS při mikromolárních koncentracích. Poté jsem zkoumala, jak různé modifikace C-terminálu AS (zejména extenze o různé velikosti a náboji) ovlivňují růst fibril a ukázala jsem, že fúze AS s proteiny, jako je GFP, potlačují agregaci AS. Na základě těchto zjištění jsem ve spolupráci s kolegy vytvořila první racionálně...
|
|
|
Rhomboid family intramembrane proteases in prokaryotes: mechanism, substrate repertoires and biological functions in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.
Began, Jakub ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
(Czech) Proteázy z rodiny rhomboidů patří do rozsáhlé skupiny serinových intramembránových proteáz, které katalyzují proteolytické štěpení membránových proteinů uvnitř jejich transmembránových oblastí, v hydrofobním prostředí lipidických buněčných membrán. Rhomboidové proteázy byly objeveny v roce 2001 v Drosophila. V průkopnické studii (Lee et al.) byla identifikována zásadní role Rhomboidu-1 (Rhom-1), který v rané fázi vývoje oka octomilky aktivuje signální dráhu receptoru epidermálního růstového faktoru. Rhomboidové proteázy, ať už aktivní proteázy (rhomboidy) či jejich katalyticky neaktivní protějšky (rhomboidové proteiny zahrnující iRhomy a Derliny), jsou silně konzervovány, což naznačuje jejich biologickou významnost. Rhomboidy jsou přítomné napříč živočišnými říšemi, od archea po člověka, zatímco proteolyticky neaktivní rhomboidové proteiny jsou přítomné výlučně v eukaryotních organizmech. Rodina rhomboidových proteinů hraje roli v široké škále rozmanitých biologických procesů, jakými je signalizace ve vývoji metazoí, mitochondriální biogenezi kvasinek, invaze protozoálních parazitů do hostitelských buněk, kvalitativní kontrola proteinů v endoplazmatickém retikulu (ER), či bakteriální quorum sensing. Ze strukturního i mechanistického hlediska jsou rhomboidy nejprostudovanějšími z...
|
host ::
RSS.